高效液相色谱法检验水产品中甲醛含量的不确定度探究

林栩+郭媛媛

摘 要：目的：探究高效液相色谱法检验水产品中甲醛含量的不确定度，进而评定此方法检验的正确性，以期进一步提升检验质量控制的水平。方法：根据相关技术规范要求，依据测定的结果来建立其数学的模型，并科学评估各不确定度分量，再在计算扩展、合成的不确定度，最终得出测量不确定度报告。结果：高效液相色谱法检验水产品中甲醛含量是（4.16±0.13）mg/kg，而从高效液相色谱法检测水产品甲醛含量不确定分量可以看出，标准溶液制备是导致不确定度的主要因素，其次是测量重复性、样品处理的过程、样品标准曲线的拟合；而样品的定容、样品的称量不确定度可以忽略不计。结论：使用高效液相色谱法检验水产品中甲醛含量的不确定度，能够有效提升水产品监管的质量和水平。

关键词：高效液相色谱法；水产品；甲醛含量；不确定度

甲醛是常见的致癌以及致突变的物质，该物质的毒性较强，极易危害到人们的身心健康及生命安全。我国已明令禁止国家标准外食品以任意一种形式使用甲醛；但不少商販为最大限度谋取私立，仍通过各种渠道、各种防腐方式在水产品中使用甲醛，最终导致甲醛含量超标，造成食品安全问题[1]。

当前，检验检疫局多使用SC/T3025-2006标准中高效液相色谱法检测甲醛，此种检测方法的准确性比较高，具有较高的抗干扰能力；但此种检测方法的过程较为复杂。本次研究主要通过2，4-二硝基苯肼柱前衍生法检测水产品中甲醛的不确定，其目的在于寻找出影响不确定的主要因素，进而为建立科学、有效地质量控制方式提供科学依据以及理论基础，进而提升水产品质量管理力度。现将研究报告总结如下：

1.实验仪器和试药

1.1实验仪器

使用由日本岛津公司生产的、型号为LC-20AD的高效液相色谱仪器，电子天平型号选择XA204（生产企业：上海梅特勒托利多仪器有限公司）；甲醛标准溶液以及2，4-二硝基苯肼（DNPH）乙腈溶液、乙腈、色谱纯的环己烷、盐酸-氯化钠溶液和磷酸氢二钠溶液；水产品为市面上销售的鱿鱼。

1.2检验方法

1.2.1检验原理

酸性环境下甲醛和DNPH衍生反应生成2，4-二硝基苯腙；同时，使用高效液相色谱法测定苯腙类衍生物，其目的在于检测水产品中的甲醛含量。其中衍生反应的化学式为：C6H3（NO2）2NHNH2+HCH0→C6H3（N02）2NHN=C—H2+H2O[2]。

1.2.2检测方法

制备标准溶液的方法：依次稀释甲醛标准溶液，并将其配置为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mg/L系列标准溶液。

样品的测定方法：均匀地捣碎样品，并用超声提取30min后过滤。其次，将提取液和DNPH放置在60℃的水中进行衍生，时间为20min；最后，采用环己烷进行提取。

1.2.3色谱的条件

①流动相为：乙腈-水（62：38），②色谱柱为：Welch Xtimate C18柱（250mm×4.6mm，5μm），③流速为：1.0mL/min，波长为365nm、柱温为40℃；进样量为：20μL。

1.3建立数学模型

数学模型建立如下：

X=C×V×1000/m×1000

式中，X是样品中甲醛含量，C是标准曲线上所得试液甲醛浓度，V是试样定容的体积，m是试液代表的质量。

1.4不确定度分量的测量来源

依据检验的过程、样品的处理以及数学模型，可以得出水产品中甲醛含量不确定分量的来源：标准曲线拟合以及溶液制备、样品的定容以及样品的称量、测量的重复性以及样品处理的过程等。

2.结果

2.1标准曲线拟合以及溶液制备时的不确定度

2.1.1标准溶液制备时所产生的不确定度

标准溶液制备过程中，所产生的不确定度主要表现在三个方面：其一，配置过程中所使用玻璃量具的校准度；其中，玻璃量具的校准可以依据《常用玻璃量具检验规程》中相关的要求，并参照三角分布进行选择；此外，还应将制备过程中玻璃量具使用的次数（n）纳入到不确定度的考虑范围内[3]。

式中，MPE是最大允许的误差，u是不确定主度，urel是相对标准不确定度。

其二，标准品纯度；标准品的纯度，可参考标准物质证书中标准物质甲醇溶液不确定度，约为3%。其三：温度效应；实验室的温度波动应将其控制在一定范围内，通常△T为±3℃：而溶液体积膨胀的系统α应为2.1×10-4℃；使其符合矩形分布，k= 。由此可以得出，标准溶液制备时温度效应的不确定度，见表1：

2.1.2标准曲线拟合不确定度

标准溶液浓度-色谱峰面积曲线的拟合主要使用的是最小二乘法，但在拟合的过程中，须对每个浓度进行三次测定（结果见表2）。经曲线拟合后，可得出线性回归的方程：A=998994C+108 546，其中，斜率b=998994，截距α=108 546，相关的系数R2=1，由此可以得出峰面积标准的偏差是：

上述公式中，SR是标准溶液峰面积残差标准差，P是试液在使用了该曲线测定次数，其中，P=9；n则是标准系列总测定的次数，n=15； 则是试液在使用了该曲线测定9次以后，待测定浓度平均值， =0.8394g/L；

则是标准系列的平均浓度； 则是标准系列溶液浓度残差平方和。

2.2样品的称量以及样品的定容不确定度

2.2.1样品称量不确定度

样品称量不确定度主要因称量过程中天平MPE构成，鉴定证书中天平MPE应在±1mg之间，并满足正态分布，其中，置信的概率是99.7%时的k=3，那么，u（mMPD）=1/3=0.34mg。但因样品质量主要是通过样品称量与容器清零所获得，因此，共同到两次电子天平，得出，

，其中，m为样品的质量，m=20.1820g。

2.2.2样品定容不确定度

样品称量之后，采用100mL的容量瓶对样品进行定容，其中，样品定容体积相对标准不确定度是 。

2.3测量重复性不确定度

测量重复性的不确定度可划分为A类，本次研究主要对同一样品进行9次重复性、独立检测，其结果见表3：

样品制备过程中不确定度主要是对样品添加三种不同质量浓度的待测物，并分裂对其进行五次测量与回收，再在对其回收率进行评定，其中，评定的类别为A类，具体结果见表4：

2.4样品回收率的不确定度

2.5合成的不确定度

合成的不確定度主要是根据各个不确定度的分量得出相对合成的不确定，其中：urel（Cstd）为1.13×10-2，urel（std）为1.54×10-3，urel（m）为2.34×10-5，urel（V定容）为1.54×10-3，urel（n）为1.54×10-3，urel（ree）为1.54×10-3。

而合成的不确定公式为：u=urel× =1.25×10-2。

2.6扩展的不确定度

若取置信的概率95%，k=2时，扩展不确定度则是U=k×u=2.49×10-2。

2.7测量不确定度的报告

本次研究水产品中，甲醛的含量是（0.84±0.025）mg/L，其中，样品的制量是20.1820g；依据所建立的数学模型，可以得出结果是：（4.16±0.13）mg/kg。

3.结语

使用高效液相色谱法检验水产品中甲醛含量是（4.16±0.13）mg/kg，而从高效液相色谱法检测水产品甲醛含量不确定分量可以看出，测定不确定度从大到小依次是：标准溶液制备、测量重复性、样品处理的过程、样品标准曲线的拟合、样品的定容、样品的称量。而在整个实验的过程中，通过使用高密度玻璃器具、提升标准溶液系列的标准点数、重复测量的次数以及严格参照规范对样品进行处理，能够有效降低测量的不确定度，进而提升检验结果的可靠性以及准确性，最终提升实验室控制的质量以及水产品监管的质量。

参考文献：

[1]曹国华，郑剑萍，杜玮，等.柱前衍生高效液相色谱法测定盐酸四环素原料药中微量甲醛含量[J].中国药业，2015，24（6）：42-44.

[2]杜光宇，张男.测定室内空气中甲醛含量的高效液相色谱法[J].工业卫生与职业病，2016，42（2）：140-142.

[3]马秋冉，张璐，戴青，等.柱前衍生化-高效液相色谱法检测疫苗中游离甲醛含量[J].中国兽药杂志，2016，50（8）：20-23.