采用固相萃取/高效液相色谱法测定保健食品中12种双酚类化合物的迁移量

曹晨 李文斌 宋青 孙欣 任硕 程甲 陈迪 邓晓军

双酚类化合物中比较典型的有双酚A、双酚F、双酚S、双酚一A二环氧甘油醚(BADGE)、双酚一F二环氧甘油醚(BFDGE)、酚醛清漆甘油醚(NOGE)及其衍生物等，容易造成人类的内分泌系统、免疫系统、神经系统异常，不仅具有“致癌、致突变、致畸”的危害，还会严重干扰人类的生殖遗传功能。这些双酚类物质广泛应用于食品接触材料的生产过程中，易通过食品包装容器和塑料薄膜迁移至食品或饮料中，我国以BADGE和BFDGE为内涂层的食品包装为主要成分，当与食品接触时这些物质就可能会迁移到食品中，对人体雌雄激素比例失调起着不容忽视的作用［1］。欧盟法规(EC/1985/2 005号指令)规定对双酚A二缩水甘油醚(BADGE)及其衍生物双酚A－双(2，3－二羟基丙基甘油醚)(BADGE·H2O)、双酚A－双(2，3－二羟基丙基醚)(BADGE·2H2O)在食品或食品模拟物中的迁移总量不超过9 mg/kg，单一各类在食品或食品模拟物中的迁移总量不超过1 mg/kg［2］。同时我国国家标准规定双1酚S在食品或食品模拟物中的迁移限量为0.05 mg/kg［3］。目前对于环境、水样、化妆品和食品接触材料中双酚类化合物检测方法的报道较多，但是对于保健食品中双酚残留的研究较少。对于测定双酚残留可以采用气相色谱－质谱法［4］、液相色谱 － 质谱法［5－8］，液相色谱法等［9－11］。其中气相色谱－质谱法前处理方法操作复杂，需要对双酚衍生化后进行测定;液相色谱－质谱法灵敏度高，但仪器和实验耗材的成本高;液相色谱法作为常规检测设备，采用荧光检测方法检测器结合前处理条件优化后也可以获得较好的灵敏度，因此被广泛应用于双酚类等检测。王延翠等［9］、汪辉等［11］采用该技术对水中双酚A及双酚S等双酚类化合物进行检测。已有的文献中尚无对于保健食品中的多种双酚类化合物检测方法的报道。于2016年10月开始采用乙腈水提取，固相萃取净化，高效液相色谱配荧光检测器测定保健食品中12种双酚类化合物的迁移量，方法具备简单、高效、检测成本低，同时满足欧盟等国家和地区的法规要求等特点。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 LC－20高效液相色谱仪:配有荧光检测器(日本岛津公司);ProElut CARB固相萃取小柱(100 mg/3 mL，Dikma公司);BPA和BPF标准品(纯度＞95%，日本TCI公司);BFDGE标准品(纯度＞95%，德国 Dr．Ehrenstorfer公司);BPS标准品(纯度 ＞99%，美国 Admas公司);BADGE、BADGE-H2O、BADGE-2H2O、双酚 A－(3－氯－2－羟丙基甘油醚)(BADGE-HCl)、双酚 A－双－(3－氯－2－羟丙基)甘油醚(BADGE－2HCl)、双酚 A－(3－氯－2－羟丙基)(2，3－二羟丙基醚)(BADGE-H2OHCl)、双酚 F－双(2，3－二羟基丙基醚)(BFDGE－2H2O)、双酚 F－双 －(3－氯 －2－羟丙基)甘油醚(BFDGE－2HCl);乙腈、甲醇、甲酸，均为色谱纯;实验用水经Millipore系统处理的超纯水。

1.2 标准溶液的配制 称取适量标准品(精确至0.001 g)，分别用甲醇溶解配制浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，保存于2～4℃冰箱内，有效期6个月。用50%甲醇水溶液将各标准储备液稀释成BPA、BPF、BPS、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O·HCl、BFDGE、BFDGE·2H2O、BFDGE·2HCl 为5.0 μg/mL;BADGE、BADGE·H2O、BADGE·2H2O 为100.0μg/mL的混合标准工作溶液，保存于2～4℃冰箱内，现用现配。

1.3 样品前处理 固体或粉状样品称取0.5 g，加入2 mL水混匀，加入10 mL乙腈、2 mL 200 g/L乙酸铅、2.0 g氯化钠(胶囊类产品直接称取0.5 g内容物后，加入 10 mL乙腈)，振荡 5 min，8 000 r/min离心2 min，收集上清液;向下层残渣中加入10 mL乙腈，按照步骤重复提取一次，合并上清液;将上清液在35℃水浴下减压蒸干，加入5 mL水，混匀，取1 mL待净化。分别加入3 mL乙酸乙酯、3 mL甲醇、3 mL水，活化SPE小柱，弃去流出液，将待净化液加入柱中，弃去流出液，向柱中加入3 mL 20%甲醇水，弃去流出液，抽干小柱，向柱中加入5 mL甲醇∶乙酸乙酯(1∶2)，收集洗脱液，在40℃下氮吹至干，用50%甲醇水定容至1 mL，过0.22μm滤膜，供HPLC分析。

1.4 液相色谱条件 Platisil PH(反相色谱苯基柱)，250 mm×4.6 mm，5μm。流动相A为水，流动相B为乙腈;流速1.0 mL/min;进样量20μL;柱温30℃;激发波长:227 nm;发射波长:313 nm。梯度洗脱:0～10 min，60%A;10～27 min，60% ～40%;27 ～30 min，40% ～60%;30～75 min，60%。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择: 选择Platisil PH柱是因为与C8、C18类型的色谱柱比较后发现，其疏水性较弱于其他两个类型的色谱柱，且表面含有的苯基基团与含苯基化合物容易发生π-π相互作用，对于双酚类化合物具有独特的选择性。另外，表面的高密度键合和独有的封端技术，增强了柱子的稳定性。经过实验发现对12种双酚类化合物都能做到基线分离且稳定性良好，12种标准品的色谱图如图1所示。

图1 12种标准品的HPLC色谱图

2.1.2 流动相及洗脱条件的选择: 分别考察了甲醇—水和乙腈—水的流动相系统对于目标化合物分离程度的影响。以乙腈为有机相时12种目标物响应值比较稳定，分离度能够达到方法学要求;而以甲醇为有机相时多个目标物的相应值明显降低，无法满足基线分离的要求。除考察流动相组成外，还比较了流动相梯度变化对化合物分离程度及峰型的影响。实验中发现在27 min后必须通过降低有机相比例，使试样中的杂质峰对前面的目标化合物的分离度及峰型的影响降低，特别是对于油脂含量较高的样品。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取液的优化: 根据双酚类化合物易溶于乙腈、丙酮、甲醇等有机溶液的特性，比较了甲醇和乙腈两种试剂对保健品中双酚类化合物的提取效果。如图2所示，乙腈可以从基质中充分提取目标化合物，故而最终选择乙腈溶液作为提取溶液。同时对于蛋白粉等固体保健食品，需要用水溶解样品，在氯化钠存在下采用乙腈提取，利用乙腈与盐饱和水溶液分层的特性，充分提取化合物及除掉水溶性杂质。对于胶囊油类样品，采用有机溶剂直接提取，乙腈与油类样品可完全乳化，可充分提取样品中目标化合物。

图2 使用不同提取溶剂的前处理方法对目标化合物回收率的影响

2.2.2 固相萃取柱的选择: 固相萃取法因其操作步骤简单，溶剂用量少，提取效率高的特点被广泛应用于样品的前处理过程中，根据双酚类化合物的特点，常用的固相萃取柱有C18柱、HLB柱、活性炭柱等。保健食品因为产品类型多，基质比较复杂，为了能够找到同时满足胶囊类、口服液类、固体粉剂类3种基质提取净化要求的固相萃取柱，分别比较了C18柱、HLB柱、活性炭CARB柱的净化效果。经过对3种基质的加标回收试验发现，C18柱对于口服液类样品的提取效果明显，但是油脂含量较高的样品例如胶囊类产品的提取效果不好;HLB柱属于反向吸附剂，因其兼具亲水基团和疏水基团，对极性和非极性的化合物都有很好的保留效果，但是对BADGE物质出峰位置有杂质峰干扰，影响结果分析。CARB小柱可吸附具有平面结构的色素、芳香烃等物质，经CARB处理后的样品，BADGE出峰位置杂质峰明显减少，且3种基质的样品的回收率均满足实验要求，故最终选择石墨化炭黑型ProElutCARB固相萃取柱。如图3中所示为胶囊类样品中添加BADGE、BADGE-H2O、BADGE-2H2O 3种化合物1.0 mg/kg、BPA、BPF、BPS、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O·HCl、BFDGE、BFDGE·2 H2O、BFDGE·2HCl 9种0.05 mg/kg的色谱图，27 min之后的4 个化合物 BPS、BFDGE、BADGE －2HCl、BADGE-HCl，能够达到基线分离的要求。

图 3 胶囊类保健品(BPA、BPF、BPS、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O·HCl、BFDGE、BFDGE·2H2O、BFDGE·2HCl 9 种0.05 mg/kg;BADGE、BADGE·H2 O、BADGE·2H2 O 3 种 1.0 mg/kg)添加回收色谱图

2.3 方法学验证

2.3.1 检出限(LOD)和定量线(LOQ): 空白基质溶液中加入系列混合标准溶液，以峰面积对应的浓度作图。表1结果表明，12种化合物在各自的范围内线性关系良好，相关系数(r)均＞0.999。分别以3倍信噪比(S/N＞3)和10倍信噪比(S/N＞10)计算得到12种双酚类化合物的检出限(LOD)及定量限(LOQ)分别为0.02～0.3 mg/kg及0.05～1.0 mg/kg。12种双酚类化合物的相关系数、线性范围及检出限见表1，标准品色谱图见图1。

表1 12种双酚类化合物的线性范围、相关系数、检出限及定量限

表2 4种基质中双酚类添加回收率范围

2.3.2 准确度与精密度:选择4种不含双酚类的样品类型(鱼油胶囊、胶原蛋白口服液、维生素片、乳基蛋白粉)进行加标回收率实验，添加12种双酚类标准品，进行3个水平的标准添加回收实验。根据现行的欧盟法规要求确定了 BADGE、BADGE·H2O、BADGE·2H2O 3种化合物的添加水平为1.0、2.0和20 mg/kg，其他9种化合物的添加水平为0.05、0.1和1.0 mg/kg［2］。3个水平的平均回收率在71.3% ～118%(n=6)之间，相对标准偏差(RSD)为4.6% ～12.8%(n=6)，方法的回收率和精密度良好(表2)。

2.3.3 实际样品检测 采用本方法对市场上购买的口服液、胶囊和粉状等3种不同类型基质共计37个保健食品进行检测。在1个胶囊类的保健品中检出BPA、BADGE·2HCl残留，含量分别为0.08 mg/kg和0.12 mg/kg，说明双酚类化合物有存在通过食品包装材料迁移到保健品中风险，但含量较低，未超过双酚类化合物的迁移总量要求。

3 结论

本文建立了固相萃取/高效液相色谱法同时测定保健食品中12种双酚类化合物的迁移量方法。方法的定量限(LOQ)为0.05～1.0 mg/kg。方法操作简单、快速、灵敏度高、重现性好，满足现行法规要求的同时，可实现保健食品中双酚类化合物迁移量的快速检测。

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