反相高效液相色谱法测定豆制品中碱性橙2

丁晓静 张晶 邵兵 赵珊

碱性橙2(chrysoidine)亦称王金黄、块黄，CAS:532 －82 －1，分子式 C12H12N4·HCl，相对分子质量为248.72。因具有与蛋白结合牢固的特点而被不法分子用于豆制品染色。《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中明确了豆腐皮中添加王金黄。由于豆制品在大众的日常饮食中占有较大比重，该物质的添加将极大危害人民群众的健康。因此，建立简便、快速、准确的方法检测该违法添加成分十分必要。高效液相色谱法和高效液相色谱—质谱/质谱联用法成为目前检测非法添加工业染料的主要方法［1－13］。本实验室曾经建立了超高效液相色谱—电喷雾串联四极杆质谱法检测豆制品中12种禁用工业染料的筛查确证方法［6］，于2017年3月在该法基础上，针对着色能力强的碱性橙2开展样品前处理研究，进一步优化样品提取、净化条件，提高液相色谱法的检测灵敏度，从而解决实际样品中碱性橙2的准确测定问题。将该法用于实际样品的检测，获满意结果。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂 Waters 2695－996型高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器。Milli-Elix/RiOs超纯水仪(美国Millipore公司);Vortex Genie 2型多用途旋涡混合振荡器(美国 Scientific Industries公司);08855－02型超声波清洗仪(美国Cole-Parmer公司);低温离心机(美国Beckman公司)。Oasis混合型阳离子交换(MCX)固相萃取柱 (3 mg，6 cc，美国Waters公司);冰乙酸(≥99.8%，北京化学试剂公司);乙酸铵(分析纯，北京化学试剂公司);甲酸、氨水(优级纯，北京化工厂)、乙腈、甲醇(色谱纯，Dikma科技有限公司)。

1.2 标准溶液配制 标准储备液:准确称取适量碱性橙2标准品，用少量50%乙腈水溶解，再用乙腈定容，制成1 000 mg/L标准储备液，－18℃以下保存，标准储备液在12个月内稳定。标准系列工作液:用80%乙腈—水将标准储备液稀释成0.50、1.0、2.0、5.0、10.0和15.0 mg/L作为工作曲线，临用时配制。1.3 阳性腐竹样品的制备 为了体现与实际样品的一致性，本实验室制备了腐竹阳性样品，具体方法:将腐竹样品粉碎、加入适量碱性橙2标准溶液，充分混匀，冷冻干燥、备用。该阳性样品用于优化前处理方法。

1.4 样品提取 称取1 g(精确到0.01 g)粉碎的豆制品样品于50 mL塑料离心管内，先加入2.5 mL 0.4%乙酸—20 mmol/L乙酸铵水溶液、混匀，然后再加入10 mL乙腈，涡旋混匀15 s，超声提取30 min，静置分层，4 ℃ 9 000 r/min离心10 min，转移上清液于另一50 mL刻度管内。残渣中再加入2.5 mL溶液混匀、10 mL乙腈重复提取一次，合并上清液。

1.5 样品浓缩、净化 MCX固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，保持柱体湿润。取经冷冻、离心净化的乙腈提取液10 mL，用200μL甲酸酸化，转移至经活化的MCX固相萃取柱，用3 mL甲醇淋洗，然后将MCX柱抽干，用3 mL 5%氨水—甲醇溶液洗脱目标化合物，收集洗脱液，35℃氮吹浓缩至近干，用0.5 mL 80%乙腈—水溶液溶解，9 000 r/min离心5 min或过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，上机测定。

1.6 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(5μm，4.6 mm×250 mm);流动相:A，0.4%乙酸－20 mmol/L乙酸铵水溶液;B，乙腈;梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1。流速:1.0 mL/min;进样量:10μL;检测波长:430 nm。采用二极管阵列检测器，保留时间定性的同时，再比较化合物特征吸收光谱图定性(表1)。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择

2.1.1 样品提取条件的选择: 对于脱水的豆制品如腐竹、豆腐皮等，若直接用乙腈提取，则乙腈不易渗透到样品组织内，而先往这些样品中加入少量水，可使样品充分吸水溶胀后再用乙腈提取。在前期研究工作中比较了水—乙腈、水—乙酸—乙腈及水—硫酸铵—乙腈三种溶剂对提取目标化合物的提取效率［6］，从结果来看，水—硫酸铵—乙腈的提取效率相对较低，水—乙腈提取率相对较高，水—乙酸—乙腈的提取率较高，碱性橙2可到达90%左右。此外，豆制品中蛋白的等电点在pH 4.5左右，选择水—乙酸—乙腈(0.4%乙酸)作为提取溶剂有利于蛋白沉淀。

2.1.2 样品浓缩、净化条件的选择:为提高检测灵敏度，样品提取液需采用MCX柱浓缩、净化后方能进样测定。分别试验了2%及4%三氯乙酸沉淀蛋白提取碱性橙2，结果显示提取率小于10%，由此可见，仅仅采用酸性水溶液不能有效提取豆制品中王金黄;固定提取液中0.4%乙酸含量不变，又分别试验了不同比例的乙腈的提取效果，随着乙腈含量从30%、50%、60%、70%、80% 的逐步递增，回收率亦逐渐增加，70%、80%乙腈回收率高于85% ～90%，提取效果最好。故选择80%乙腈—0.4%乙酸为提取液。保持提取液中80%乙腈含量不变的条件下，对酸度进行进一步优化，比较不同酸度条件下的提取效果，乙酸由0.4%、0.8%、1.2%到1.6%，随着酸度的增加，回收率反而降低，可能的原因是当酸性增强，碱性橙2分子中的氨基离子化效应增强，反而不易被乙腈萃取，而在提取液中加入20 mmol/L乙酸铵，可使带负电的乙酸根与带正电碱性橙2形成离子对，从而有利于乙腈提取。文献报道选择混合型弱阴离子交换柱净化提取液中的碱性橙2［2］，回收率在90%左右，由于碱性橙2为含氮弱碱性化合物，更适合混合型阳离子交换(MCX)SPE柱净化，因此，试验了基质加标样品过MCX固相萃取柱净化、浓缩，其过柱回收率为90%左右，在430 nm检测，无干扰，检测灵敏度较高。

2.1.3 液相色谱—紫外检测条件的选择: 碱性橙2的极性较强，上样液为80%乙腈—水溶液，乙腈—水溶液分离时，溶剂化效应严重，导致碱性橙2的峰展宽，灵敏度下降，且色谱峰的重现性差。流动相中加入0.4%乙酸—20 mmol/L乙酸铵时，酸性条件下，碱性橙2带正电，与乙酸根阴离子可形成离子对，在色谱柱的保留增强，减弱了溶剂化效应，峰形改善，灵敏度提高。

2.1.4 检出限、定量限、线性: 用80%乙腈—水，将标准储备液稀释成 0.50、1.0、2.0、5.0、10.0 和15.0 mg/L的标准工作溶液，以外标法定量，线性方程为y=35 800x－333，线性相关系数r2=0.999 9。在样品基质中加入一定量的碱性橙2，按上述条件提取、净化，HPLC测定，以信号和噪音(S/N)S/N=10的信号所对应的量为检出限，S/N=3的信号所对应的量为定量限，分别为0.13 mg/kg和0.4 mg/kg。

2.1.5 回收率和精密度: 分别准确称取腐竹空白样品各6份，每份1 g(精确到0.01 g)，共分3组。碱性橙2的添加水平分别为0.5 mg/kg、5.0 mg/kg和10.0 mg/kg，测得回收率和精密度结果见表2，腐竹中不同浓度平均加标回收率为77.8% ～83.6%，相对标准偏差为3.0%～3.5%(n=6)。标准溶液和空白样品加标色谱图分别见图1和图2，紫外吸收光谱图见图3。

表2 HPLC测定豆制品中碱性橙2回收率和相对标准偏差(n=6)

图1 碱性橙2标准溶液色谱图/10 mg·kg－1

图2 空白样品加标溶液色谱图/10mg·kg－1

2.1.6 实验室间方法验证: 本方法经北京市食品安全监控和风险评估中心、成都市食品药品检验研究院、辽宁省食品检验检测院、山东省食品药品检验研究院、四川省食品药品检验检测院共5家实验室对该方法进行了协同验证试验。验证样品基质为腐竹，3个添加浓度水平、每个浓度水平进行6次重复实验，均获得了满意结果，充分证明该方法的普遍适用性，易于推广使用。

图3 碱性橙2标准溶液紫外吸收光谱图

3 结论

本方法能够对豆制品中碱性橙2进行有效提取，净化并准确定量，操作简便，检测灵敏度满足样品定性、定量的要求，适用于豆制品中碱性橙2的检测。

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