HPLC-MS/MS法快速检测人血中钩吻毒素

宋 蕊武继锋刘海燕栾玉静

（1 济南市公安局刑事科学技术研究所 山东 济南 250002；2 公安部物证鉴定中心 北京 100038）

HPLC-MS/MS法快速检测人血中钩吻毒素

宋 蕊1武继锋1刘海燕1栾玉静2

（1 济南市公安局刑事科学技术研究所 山东 济南 250002；2 公安部物证鉴定中心 北京 100038）

建立了利用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）快速检测人血中两种钩吻毒素（钩吻素甲和钩吻素子）的定性定量分析方法。采用乙腈沉淀蛋白法处理血液，HPLC-MS/MS多反应监测（MRM）记录模式，保留时间和定性离子对定性，标准曲线法定量。钩吻素甲、钩吻素子的检测限在0.5ng/mL，线性范围在1ng/mL～1μg/mL，平均回收率为85.2%～98.7%。该方法样品前处理方法操作简便，灵敏度较高，线性范围较宽，适用于钩吻中毒案人血中钩吻素甲和钩吻素子的快速检测。

高效液相色谱-串联质谱法 血 钩吻素甲 钩吻素子

1 引言

钩吻（Gelsemium elegans Benth，GEB）为马钱科（Loganiacease）、钩吻属（Gelsemium）植物胡蔓藤的全草，分为中国钩吻和北美钩吻两种，又名断肠草、胡蔓草、野葛、大茶藤、黄藤、大炮叶、大茶药等。其外形似金银花，是一种重要的中药材，具有抗炎、祛瘀止痛、杀虫止痒、镇痛、镇静、抗肿瘤等活性，主要分布于我国的浙江、福建、广东、广西、贵州、云南和湖南等地。钩吻的应用历史相当悠久，在美国药物索引、日本《世界的民间药》，以及我国的《神农本草》和《本草纲目》已有其药用记载，其根、茎、叶经处理后可用来治疗风湿痹痛、湿疹、神经痛、痈肿等病症。钩吻全株剧毒，尤其嫩叶更毒，被认为是世界上最毒的植物之一，人误食后可迅速致死[1]。近年来，因误食钩吻而中毒死亡的案件呈逐年攀升趋势。因此，研究用于钩吻毒素鉴定的分析方法具有重要的意义[2]。

目前报道的钩吻毒素检验手段主要为薄层色谱法[3]、液相色谱-紫外法[4]、气质联用仪法检测[5]、pH区精制逆流色谱法[6]、固相萃取-气质联用-同位素峰形校正检测技术[7]等。目前各类案事件中，主要以检验是否存在钩吻素甲（Gelsemine）作为钩吻中毒的研判依据，而事实上因钩吻素甲也广泛存在于其他马钱科有毒植物（如醉鱼草）中，单一的钩吻毒素检测无法作为钩吻中毒的直接关联证据[8]。此外，根据文献报道，钩吻素子（Koumine）是钩吻总生物碱中含量最多的，其次才是钩吻素甲[9]。因此，测定人体液、组织或血液中钩吻素甲和钩吻素子的含量有助于钩吻中毒鉴定及解救方案的制定。

本研究利用HPLC-MS/MS测定方法，建立了人血液中钩吻素甲、钩吻素子的检测方法，同时建立复杂基质中钩吻毒素标志物的检验方法，有效解决了钩吻中毒案例中的检验难题，为中毒诊断、中毒解救提供参考依据和技术支撑。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

DGU-20A高效液相色谱（日本岛津公司）；4000 Q Trap液相色谱-质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）；Centrifuge 5804高速离心机（德国Eppendorf公司）。

钩吻素甲、钩吻素子标准品购于中国科学院成都生物研究所，纯度分别为99.75%、99.56%。标准品储备液：精密称取钩吻素甲、钩吻素子标准品10mg，置于10mL容量瓶中，加少量甲醇溶解并定容至刻度，4℃冰箱中保存，备用。

2.2 样本制备

空白血液：采购于血站的新鲜血液。标准溶液：取标准溶液分别稀释至0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL。空白添加样本：取空白血液11份，每份1mL，添加标准溶液至浓度分别为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL。

取空白血、添加样本分别加入2mL乙腈充分混旋，超声10min，8000rpm离心5min，过0.22μm有机过滤膜过滤后供仪器分析。

2.3 仪器检测条件

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent，Eclipse Plus C18柱（4.6mm ×50mm，5μm），流动相为A：甲醇，B：0.1%甲酸+10mM甲酸铵溶液，梯度洗脱程序如表1所示。流速0.8mL/min，柱温40℃，进样量2μL。

表1 LC梯度洗脱程序

2.3.2 质谱条件

采用ESI正离子多反应监测（MRM）模式，电离电压5.5kv，离子源温度550℃，雾化气压力55psi。钩吻素甲、钩吻素子的MRM离子及所需去簇电压（DP）和碰撞能（CE）如表2所示，保留时间分别为3.24、3.45min。

表2 钩吻素甲和钩吻素子的MRM离子及DP和CE

3 结果与讨论

3.1 仪器条件的选择

钩吻素甲、钩吻素子的精确分子量分别为322.17、306.17。在ESI源下，母离子筛选情况如表3所示。在Product Ion 步骤中，将不同母离子产生的子离子峰按峰度大小排列，钩吻素甲及钩吻素子母离子均定为 （M+H）+峰。

液相色谱条件的水相选择甲酸+甲酸铵溶液，可以使目标检测物更易离子化，并能改善化合物的峰形。相较于甲醇，选择乙腈作为有机相时，钩吻素甲和钩吻素子的色谱峰分离效果更好。

表3 钩吻素甲和钩吻素子的母离子筛选表

3.2 标准工作曲线

按照本文方法检测钩吻素甲和钩吻素子标准溶液，用目标化合物定量离子对的峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，ng/mL）为横坐标绘制标准工作曲线，得到钩吻素甲和钩吻素子线性回归方程分别为Y=102.33X+39.46（R2=0.9999），Y=154.5X+675.25（R2=0.9996），如图1、图2所示。相关系数R2均大于0.999，表明化合物在相应浓度范围内线性关系良好。

图1 钩吻素甲的标准工作曲线

图2 钩吻素子的标准工作曲线

3.3 方法的线性关系

取空白血1mL分别加入一系列浓度的钩吻素甲和钩吻素子准液使其在每一种样品中的添加浓度分别为1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL，每个浓度3个样本，按本文方法进行分析检测，用目标化合物定量离子对的峰面积（Y）对质量浓度（X，ng/mL）求得线性回归，得到钩吻素甲和钩吻素子在血中的线性回归方程分别为Y=91.257X-68.72（R2=0.9993），Y=158.96X-942.96（R2=0.9982），工作曲线如图3、图4所示。结果表明血中的钩吻素甲和钩吻素子在1ng/mL~1μg/mL浓度范围内有着良好的线性关系。

图3 血中钩吻素甲的工作曲线

图4 血中钩吻素子的工作曲线

3.4 方法的回收率

取空白血1mL，分别加入一系列浓度的钩吻素甲、钩吻素子标准液使其在每一种样品中的添加浓度分别为1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL，每一样品每一浓度平行5份，按本文方法分析检测，以测得的添加各样品中目标物的峰面积与对照品相同浓度峰面积的比值来计算回收率（见表4）。在线性关系的所有浓度范围内，平均回收率均大于85.2%，相对标准偏差均小于6.3%。结果表明该方法回收率良好。

表4 钩吻素甲和钩吻素子的回收率

3.5 方法的精密度考察

取空白血1mL分别加入一系列浓度的钩吻素甲、钩吻素子标准液使其在每一种样品中的添加浓度分别为10、50、500ng/mL，每个浓度平行3个样本，在同一天内早、中、晚时段分别用本文方法进行分析检测，计算目标物峰面积的相对标准偏差，得到日内精密度。连续测3天，计算目标物峰面积3天的相对标准偏差，得到日间精密度（见表5）。结果表明该方法有良好的重现性。

表5 钩吻素甲和钩吻素子的精密度

3.6 方法的灵敏度

以信噪比10/1计，该方法钩吻素甲、钩吻素子的最小定量限均为1ng/mL，以信噪比3/1计，该方法钩吻素甲、钩吻素子的最小检出限均为0.5ng/mL。

3.7 方法的专属性

取空白血，加入钩吻素甲、钩吻素子标准溶液，按本文方法进行分析检测，同时做空白血的对照试验，将两者的图谱进行比较（见图5~8）。结果在钩吻素甲、钩吻素子出峰时间段内，空白检材均未出现明显的色谱峰，表明生物检材中内源性杂质不会对钩吻素甲、钩吻素子的测定造成干扰，说明实验建立的方法具有较高的专属性。

图5 空白血液钩吻素甲色谱图

图6 血添加钩吻素甲色谱图

图7 空白血液钩吻素子色谱图

图8 血添加钩吻素子色谱图

综上，本文建立了人血中两种钩吻毒素（钩吻素甲和钩吻素子）的提取净化和检测方法。所建立方法操作简便、实用性强、回收率高、重现好，能够有效去除杂质干扰，提取产物色谱图比较干净。血中添加标准的提取回收率均在85.2%以上，且在1ng/mL~1μg/mL的范围内线性关系良好。所建立方法不受生物检材中内源性杂质的干扰且分离度好，方法的最低检出限为0.5ng/mL，解决了复杂基质中钩吻毒素的快速检验难题，可应用于医学、法医学领域中钩吻中毒案例的诊断与鉴定。

[1]Jin GL,Su YP,Liu M,et al.Medicinal plants of the genus Gelsemium (Gelsemiaceae, Gentianales)—a review of their phytochemistry, pharmacology, toxicology and traditional use[J]. J.Ethnopharmacol.,2014(1):33-52.

[2]Zhang JY,Wang YX.Gelsemium analgesia and the spinal glycine receptor/allopregnanolone pathway[J]. Fitoterapia,2015(100):35-43.

[3]黄伟雄,李汴生,范山湖,等.应用TLC法鉴定断肠草中的钩吻碱[J].华南预防医学,2008(1):60-62.

[4]丘宏强,程昱,刘茂柏,等.人血浆中钩吻素甲和钩吻素子HPLC-UV测定[J].中草药,2016(13): 2324-2327.

[5]吴惠勤,黄春华,黄晓兰,等.气相色谱-串联质谱法同时检测尿液中15种有毒生物碱[J].分析测试学报,2013(9):1031-1037.

[6]Su YP,Shen J,Xu Y,et al.Preparative separation of alkaloids from Gelsemium elegans Benth. using pH-zone-refining countercurrent chromatography[J].J.Chromatogr. A,2011(23):3695-3698.

[7]罗达龙.固相萃取-气质联用结合同位素峰形校正检索技术分析钩吻中的钩吻碱和钩吻碱子[J].药物分析杂志,2016(1):96-101.

[8]龙军标,周金森,梁志轩.一起误食断肠草引起家庭性食物中毒的调查分析[J].实用预防医学,2013(12):1472-1473.

[9]叶丽香,苏燕评,曹大炫,等.UPLC测定钩吻素子的含量及其水溶液稳定性[J].中国现代应用药学,2015(4):471-474.

（责任编辑：孟凡骞）

Rapid Determination of Gelsemine and Koumine in Blood by HPLC-MS/MS Technique

SONG Rui1WU Ji-feng1LIU Hai-yan1LUAN Yu-jing2
(1 Institute of Criminal Science and Technology of Jinan Bureau of Public Security Shandong Jinan 250002; 2 Institute of Forensic Science Ministry of Public Security P.R.C. Beijing 100038)

A qualitative and quantitative analysis method of rapid determination of the gelsemine and koumine in blood by HPLC-MS/MS technique is established. Gelsemine and koumine in blood were extracted by acetonitrile and determined by HPLC-MS/MS. The qualitative analysis was based on retention time and MRM ions. The quantitative analysis was based on a calibration curve. The detection limits of gelsemine and koumine were 0.5ng/mL. The linear curve covered the range of 1ng/mL～1μg/mL and the average recovery rate was 85.2%～98.7%. The HPLC-MS/MS method, which is simple, sensitive and has a wide linear range, can be applied to the rapid detection of gelsemine and koumine in human blood.

HPLC-MS/MS Blood Gelsemine Koumine

D918.92

A

2095-7939(2017)02-0103-04

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.02.021

2016-12-07

国家自然科学基金项目（编号：81273346）。

宋蕊（1988-），女，山东菏泽人，山东省济南市公安局刑事科学技术研究所初级工程师，主要从事刑事毒物毒品分析研究。