超声波辅助酶法提取胡桃楸种仁壳多糖的工艺优化

王秋阳+沙迪+徐红艳

摘要：为确定胡桃楸（Juglans mandshurica）种仁壳多糖超声波辅助酶法提取工艺条件，在单因素试验基础上，选取纤维素酶添加量、超声时间、超声功率为自变量，多糖得率为响应值，采用响应面法模拟得到二次多项式回归方程，并确定种仁壳多糖最佳工艺参数为纤维素酶添加量0.31%，超声时间40 min，超声功率400 W。其中超声功率对胡桃楸种仁壳多糖得率影响最大，其次是纤维素酶添加量，影响最小的是超声时间，回归模型预测的多糖得率理论值为1.35%。经验证试验，RSD为0.97%，该回归方程与实际情况拟合较好。

关键词：胡桃楸（Juglans mandshurica）种仁壳；多糖；提取工艺；酶法；超声波；响应面

中图分类号：S792.132；TS255.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1315-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.030

Optimization of Ultrasonic-assisted Enzyme Extraction of Polysaccharide from Juglans mandshurica Seed Shell by Response Surface Methodology

WANG Qiu-yang，SHA Di，XU Hong-yan

（College of Agricultural，Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract：To optimize ultrasonic-assisted enzyme extraction of polysaccharide from seed shell of Juglans mandshurica，single factor test were carried out. Based on this，enzyme amount，ultrasonic time and ultrasonic power were selected as variables. And a mathematical model was obtained according to response surface methodology. Results showed that the following optimum parameters：enzyme amount 0.31%，ultrasonic time 40 min，ultrasonic power 400 W. The effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides was primary，effect of enzyme amount was secondary，and effect of ultrasonic time was last. The predicted value of extraction yield of polysaccharide was 1.35%. After confirmatory test，the relative standard deviation was 0.97%. The regression equation was fitting better with actual situation.

Key words：Juglans mandshurica seed shell；polysaccharide；extraction technology；enzyme；ultrasonic-assisted extraction；response surface methodology

胡桃楸（Juglans mandshurica）又名核桃楸、山核桃、楸樹，为胡桃科胡桃属落叶乔木，在东北分布广阔[1]，是珍贵的用材树种，也是重要的药源植物，其叶、树皮、根及果实均可入药[2]。胡桃楸与水曲柳、黄菠萝并称“东北三大硬阔”[3]，是国家级保护植物[4]。研究证实，胡桃楸具有抗氧化、抗肿瘤、镇痛、抗炎和杀菌等作用[5]。胡桃楸种子是林业副产品，其种仁（俗称山核桃仁）营养价值很高，早已成为人们的食疗佳品，成为研究和关注的热点[6，7]。在种仁生产过程中，产生大量的种仁壳废弃物，研究显示，胡桃楸种仁壳中含有氨基酸、多糖、皂甙、黄酮、挥发油、强心甙、香豆素类等[8]多种化学成分。目前，对胡桃楸种子的研究主要集中在种仁的营养成分和在食品加工中的应用方面[9，10]，关于种仁壳的研究较少[11-14]，而有关种仁壳多糖的相关研究鲜见报道。

多糖（Polysaccharides，PS）又称多聚糖，是由10个以上的单糖分子通过糖苷键聚合而成，是一类大分子化合物[15]。多糖广泛存在于动物细胞膜、高等植物和微生物细胞壁中，从量上讲，是碳水化合物在自然界中存在的主要形式[16]。多糖是中草药的主要活性成分之一，受到生物医学和功能性食品领域的广泛关注[17]，研究发现其具有免疫调节、抗菌、抗炎、抗病毒等生物功能[18]，具有高效、低毒的特点，并已得到广泛应用[19-21]。

本研究以加工胡桃楸种仁产生的废弃物种仁壳为原料，采用响应面法优化超声波辅助酶法提取种仁壳多糖的条件，旨在为种仁壳多糖的深入研究提供理论依据，可提高长白山胡桃楸种子的附加值，促进其综合开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

胡桃楸种子：由吉林省和龙市林业局提供。

无水葡萄糖、5%苯酚溶液、浓硫酸，均为分析纯。

UV-1800型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；BSA124S-CW型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工艺 胡桃楸种仁壳→粉碎→过60目筛→80%乙醇回流提取→抽滤→粉末晾干→加去离子水→酶解→超声波提取→离心→收集上清液→浓缩→醇沉→离心→收集沉淀→丙酮、乙醚洗涤→去离子水定容→测多糖含量。

1.2.2 标准曲线的绘制 按Xu等[22]采用苯酚-硫酸法，精确称取105 ℃真空干燥至恒重的无水葡萄糖24.0 mg，去离子水100 mL定容，得到浓度为0.24 mg/mL的多糖溶液。精确移取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL多糖溶液于比色管中，再分别加2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2 mL去离子水，然后依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液、5.0 mL浓硫酸，混匀，40 ℃水浴15 min，然后冷水冷却10 min，去离子水作空白，于490 nm波长测定吸光度，以吸光度（y）对葡萄糖浓度（x）作回归处理。得到标准曲线回归方程为y=0.009 7x+0.006 6，R2=0.994 7。

1.2.3 多糖含量的测定 按张帅等[23]方法计算多糖得率，按照以下公式：

多糖得率=C/1 000×n×V/m×100%

式中，C为按标准曲线计算的多糖质量浓度（mg/mL），n为稀释倍数，V为液体体积（mL），m为原料干质量（g）。

1.2.4 单因素试验 以多糖得率为指标，以纤维素酶添加量、料液比、超声温度、超声时间、超声功率为因素，进行胡桃楸种仁壳多糖提取的单因素试验。

1.2.5 响应面优化试验设计 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用三因素三水平响应面法，以纤维素酶添加量、超声时间、超声功率3个因素为自变量，以多糖得率为响应值，采用最小二乘法拟合二次多项方程表达响应值，试验因素和水平见表1。

1.2.6 验证试验 按照响应面优化的最佳工艺条件，提取胡桃楸种仁壳多糖，进行3次试验，考察响应面优化工艺条件的可行性。

1.3 统计分析

采用Minitab15软件进行试验方案设计与统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 纤维素酶添加量对胡桃楸种仁壳多糖得率的影响 取胡桃楸种仁壳粉5 g，按1∶20加入去离子水（g∶mL，下同），调pH为4.5，分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的纤维素酶酶解，40 ℃超声提取30 min，超声功率300 W，考察纤维素酶添加量对多糖得率的影响，结果见图1。由图1可知，随着纤维素酶添加量的增多，多糖得率逐渐增加，当添加量为0.3%时，多糖得率最大，之后开始下降。这可能是纤维素酶添加量过大，底物完全反应后，过量的纤维素酶进一步分解糖苷键而导致得率下降，故选择0.3%为纤维素酶最佳添加量。

2.1.2 料液比对胡桃楸种仁壳多糖得率的影响 取胡桃楸种仁壳粉5 g，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入去离子水，调pH为4.5，加0.3%的纤维素酶酶解，40 ℃超声提取30 min，超声功率300 W，考察不同料液比对多糖得率的影响，结果见图2。由图2可知，随着料液比的增加，多糖得率逐渐增加，當料液比小于1∶40时，增加幅度较大，之后呈缓慢增长的趋势。故选择1∶40为最佳提取料液比。

2.1.3 超声温度对胡桃楸种仁壳多糖得率的影响 取胡桃楸种仁壳粉5 g，按料液比1∶40，调pH为4.5，加0.3%的纤维素酶酶解，分别在40、50、60、70、80 ℃条件下，超声功率300 W，超声提取30 min，考察超声温度对多糖得率的影响，结果见图3。如图3所示，随着超声温度的升高，多糖得率不断增大，在50 ℃时，多糖得率达到最大，之后又开始下降，主要是由于纤维素酶要在适合的温度下才能发挥酶解作用，温度过高抑制了纤维素酶的活性，从而导致多糖得率的下降。因此，确定最佳超声温度为50 ℃。

2.1.4 超声时间对胡桃楸种仁壳多糖得率的影响 取胡桃楸种仁壳粉5 g，料液比1∶40，调pH为4.5，加0.3%的纤维素酶酶解，50 ℃条件下，超声功率300 W，分别超声提取10、20、30、40、50、60 min，考察超声时间对多糖得率的影响，结果见图4。由图4可知，随着提取时间的延长，多糖得率逐渐增加，当超声时间为40 min时，多糖得率最大，之后随着时间延长，多糖得率呈下降趋势，可能是由于长时间超声作用使部分多糖被超声波的剪切力降解以及非糖类杂质溶出过多，影响多糖得率。因此，确定最佳超声时间为40 min。

2.1.5 超声功率对胡桃楸种仁壳多糖得率的影响 胡桃楸种仁壳粉5 g，料液比1∶40，调pH为4.5，加0.3%的纤维素酶酶解，50 ℃条件下，分别在250、300、350、400、450、500 W的超声功率下，超声提取40 min，考察超声时间对多糖得率的影响，结果见图5。由图5可知，随着超声功率的增大，多糖得率逐渐增加，当超声功率达到400 W时，多糖得率最大，再增大功率则多糖得率呈下降趋势，可能是由于超声波的机械作用过大，导致多糖结构被破坏而影响多糖得率。因此，确定最佳超声功率为400 W。

2.2 响应面法优化胡桃楸种仁壳多糖提取工艺

2.2.1 响应面试验结果 根据响应面法中的Box-Behnken试验原理，按表2进行试验，对试验结果进行二次多项式逐步回归拟合，得到回归模型Y=1.283 33+0.051 25X1-0.036 25X2+0.100 00X3-0.064 17X12-0.214 17X22-0.116 67X32+0.010 00X1X2+0.032 50X1X3+0.047 50X2X3。

2.2.2 模型的显著性检验 模型的可靠性可以从方差分析及相关系数来考察，结果见表3和表4。由表3可知，一次项X3对多糖得率影响显著（P<0.05）；二次项X22对多糖得率影响极显著（P<0.01），X32对多糖得率影响显著（P<0.05）；交互项对多糖得率影响不显著（P>0.05）。

由表4可知，模型的相关系数R2=0.921 1，对种仁壳多糖提取所建立的二次多项模型回归项P值为0.027，具有显著性（P<0.05）；模型失拟项P值为0.465，不显著（P>0.05）。因此，该模型拟合度较好，可以用此模型对胡桃楸种仁壳多糖提取进行分析和预测。

图6～图8分别为纤维素酶添加量、超声时间、超声功率3个因素影响胡桃楸种仁壳多糖得率的响应面和等值线。

综合分析响应面试验结果，超声功率对胡桃楸种仁壳多糖得率影响最大，其次是纤维素酶添加量，影响最小的是超声时间。依据回归方程，响应面优化种仁壳多糖的最佳提取工艺参数为纤维素酶添加量0.305%，超声时间39.64 min，超声功率405 W，回归模型预测的多糖得率理论值为1.35%。结合实际操作，确定最佳提取工艺参数为纤维素酶添加量0.31%，超声时间40 min，超声功率400 W。

2.3 验证试验

按照最终确定的最佳工艺参数进行3次验证试验，得到多糖得率分别为1.26%、1.33%和1.29%，平均得率为1.29%，与理论预测值的相对标准偏差为0.97%，可见该模型能较好地模拟和预测胡桃楸种仁壳多糖的提取效果。

3 小结

本研究以长白山胡桃楸种仁壳为原料，采用响应面法对胡桃楸种仁壳多糖的超声辅助酶法提取工艺进行了优化。结果表明，最佳提取工艺条件为纤维素酶添加量0.31%，超声时间40 min，超声功率400 W，各因素对多糖得率影响的主次顺序是超声功率>纤维素酶添加量>超声时间。经验证试验，种仁壳多糖得率为1.29%，与理论预测值之间的相对偏差较小，表明经响应面优化的种仁壳多糖的提取条件是可行的。长白山胡桃楸种仁壳可以作为植物多糖的可开发利用资源，但关于种仁壳多糖的纯化、单糖组成分析及活性作用还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 陈思羽，杨 辉，韩 姣，等.长白山区核桃楸结实性状种源变异分析[J].北京林业大学学报，2015，37（12）：32-40.

[2] 沈广志，邹桂华，梁 婷，等.核桃楸的化学成分研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（17）：219-224.

[3] BAI W N，ZENG Y F，ZHANG D Y.Mating patterns and pollen dispersal in a heterodichogamous tree，Juglans mandshurica （Juglandaceae）[J].New Phytol，2007，176（3）：699-707.

[4] 朱红波，赵 云，林士杰，等.核桃楸资源研究进展[J].中国农学通报，2011，27（25）：1-4.

[5] 崔 哲.胡桃楸的研究进展[J].现代医药卫生，2008，24（20）：3061-3062.

[6] 于阳阳.东北核桃楸种仁蛋白提取及降血压肽制备的研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2012.

[7] 孙琳琳.长白山核桃楸种仁蛋白功能性质及其酶解产物的抗氧化活性研究[D].长春：吉林农业大学，2014.

[8] 苑雅萍，赵洪云，秦香芹，等.山核桃壳化学成分的研究[J].黑龙江医药，2006，19（1）：33-34.

[9] 王晓飞.长白山核桃楸种仁球蛋白分离纯化、性质鉴定及其功能性质研究[D].长春：吉林农业大学，2015.

[10] 颜秀娟.核桃楸仁可溶性多糖提取纯化及结构特征初步分析[D].哈尔滨：东北林业大学，2008.

[11] 徐红艳，包怡红.响应面法优化胡桃楸种仁壳总黄酮微波提取工艺[J].食品科学，2013，34（18）：32-35.

[12] 徐红艳，褚凤艳，包怡红.胡桃楸种仁壳黄酮的纯化及抗氧化性研究[J].食品工业科技，2012，33（22）：113-118，122.

[13] 包怡红，徐红艳.胡桃楸种仁壳黄酮对小鼠骨髓细胞微核影响的试验研究[J].食品科技，2013，38（12）：210-213.

[14] 徐红艳，包怡红.胡桃楸种仁壳黄酮的急性毒性和Ames试验的结果分析[J].食品工业，2015，36（4）：204-207.

[15] 牛 爽，郝利民，赵树欣，等.茯苓多糖的研究进展[J].食品科学，2012，33（3）：348-353.

[16] XIE J H，TANG W，JIN M L，et al. Recent advances in bioactive polysaccharides from Lycium barbarum L.，Zizyphus jujuba Mill，Plantago spp.，and Morus spp.：Structures and functionalities[J].Food Hydrocolloids，2016，60（10）：148-160.

[17] LIN P C，WU D T，XIE J，et al. Characterization and comparison of bioactive polysaccharides from the tubers of Gymnadenia conopsea[J]. Food Hydrocolloids，2015，43（1）：199-206.

[18] MENG X，LIANG H B，LUO L X.Antitumor polysaccharides from mushrooms：A review on the structural characteristics， antitumor mechanisms and immunomodulating activities[J].Carbohydrate Research，2016，424（4）：30-41.

[19] SINGDEVSACHAN S K，AUROSHREE P，MISHRA J，et al. Mushroom polysaccharides as potential prebiotics with their antitumor and immunomodulating properties：A review[J].Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre，2016，7（1）：1-14.

[20] 凌 昊，趙 霞.黄芪多糖治疗哮喘的机制研究进展及展望[J].浙江中医药大学学报，2016，40（1）：72-74.

[21] WU J J，SHI S S，WANG H J，et al. Mechanisms underlying the effect of polysaccharides in the treatment of type 2 diabetes：A review[J].Carbohydrate Polymers，2016，144（6）：474-494.

[22] XU Y Q，FEI C，YU Z Y，et al. Optimisation of pressurised water extraction of polysaccharides from blackcurrant and its antioxidant activity[J].Food Chemistry，2016，194（3）：650-658.

[23] 张 帅，郑宝东，林良美，等.笋壳多糖的微波-超声波联合辅助提取工艺优化及其抗氧化活性[J].食品科学，2015，36（16）：72-76.