载阿霉素的叶酸偶联羧甲基壳聚糖自组装纳米粒的研制及体外释放

张 岩, 李长鸣, 祁瑞艳, 张梦茹, 李 迪

(沈阳大学 师范学院, 辽宁 沈阳 110044)



载阿霉素的叶酸偶联羧甲基壳聚糖自组装纳米粒的研制及体外释放

张 岩, 李长鸣, 祁瑞艳, 张梦茹, 李 迪

(沈阳大学 师范学院, 辽宁 沈阳 110044)

采用化学交联法制备叶酸-羧甲基壳聚糖偶联物(FCC),用于装载抗癌药物阿霉素,形成具有肿瘤靶向功能的自组装纳米粒(DOX-FCC NPs),并对载药纳米粒的体外释放特性进行了研究.结果表明,纳米粒呈球形,粒径约为200 nm,包封率和载药量受到药物加入量的影响.该纳米粒具有良好的pH敏感释药特性,叶酸修饰可以增强药物在肿瘤部位的蓄积,减少对正常组织的毒性,达到靶向递药的效果.

叶酸; 羧甲基壳聚糖; 阿霉素; 纳米粒; 自组装

壳聚糖是一类用途很广的天然高分子化合物,具有安全无毒、生物可降解性和生物相容性好等特性,在生物医药、环保、农业、食品等领域具有良好的应用前景[1-4].但壳聚糖分子水溶性差,有必要进行结构改造提高其溶解性.羧甲基壳聚糖是壳聚糖的衍生物,壳聚糖经过羧甲基化后,破坏了原有的二次结构,降低了其结晶性,提高了水溶性,使其在中性或碱性溶液中都可以溶解,同时羧甲基壳聚糖比壳聚糖的降解速度更快,扩大了壳聚糖的应用范围[5-6].

羧甲基壳聚糖分子中具有大量的活性氨基和羧基,除了具有pH敏感性外,还可以修饰特定基团赋予其功能性.此外,羧甲基壳聚糖还可以通过离子交联或化学交联法制成纳米药物载体,用于药物递送[7].Tan等将阿霉素负载到亚油酸修饰的羧甲基壳聚糖自组装纳米粒上,对Hela细胞进行细胞毒性实验证实,药物结合到纳米粒子后同样对癌症细胞具有很好的抑制作用.尽管羧甲基壳聚糖纳米粒子在增强渗透和滞留(EPR)效应下可将药物被动输送到肿瘤组织,但药物总量较少,无法保证疗效.而如果在纳米粒子的表面修饰一些与受体特异性结合的靶向基团,赋予纳米载药粒子主动靶向功能,就可以进一步提高药物的利用效率,起到减毒增效的作用.

文献表明[8],叶酸受体在许多肿瘤细胞表面过度表达,而在正常细胞上很少表达,它可以介导叶酸纳米粒子的内吞,实现肿瘤靶向输送.此外,叶酸作为疏水性分子,接枝到羧甲基壳聚糖分子后,使其具有两亲性,提高了纳米粒自组装能力.

本文以阿霉素为模型药物,采用化学交联法制备叶酸-羧甲基壳聚糖偶联物,进而形成自组装纳米粒,叶酸分子既是靶向基团,又提供疏水片段.采用核磁共振(H-NMR)对偶联物的结构进行鉴定,采用动态光散射法(DLS)测定纳米粒的粒径,透射电镜观察粒子的形态,并对纳米粒的包封率和载药量进行测定.通过体外释放实验,对该纳米粒的pH敏感性进行了考察.

1 试验材料与试验方法

1.1 试验材料

羧甲基壳聚糖(CMCS,平均相对分子质量50 000,羧甲基取代度60%,脱乙酰度85%)购自济南海德贝海洋生物工程有限公司;叶酸(FA)购自成都科龙化工试剂厂;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)购自上海阿拉丁试剂有限公司;盐酸阿霉素购自Sigma公司;其他试剂均为分析纯.

1.2 叶酸修饰羧甲基壳聚糖偶联物(FCC)的合成及表征

采用化学交联法对FA和CMCS进行交联[9].称取0.2 g叶酸溶于10 mL DMSO中,加入0.1 g的NHS和0.2 g的DCC(n(FA)∶n(NHS)∶n(DCC)=1∶2∶2),室温活化12 h,直到FA全部溶解.向叶酸溶液中加入1%的羧甲基壳聚糖溶液(用pH值哦4.7的PBS配制)和EDC(n(CMCS)∶n(FA)∶n(EDC)=1∶1∶1),继续室温避光搅拌16 h.然后向溶液中滴加NaOH调节pH值至9.0,用pH值为7.4的PBS透析24 h,然后用水透析24 h后,冻干处理,得到FCC偶联物.采用核磁共振H-NMR(Bruker ARX300)对FCC的结构进行表征.

1.3 FCC自组装纳米粒的制备及药物装载

将FCC偶联物分散在pH值7.4的PBS中,室温放置过夜,然后用探头式超声处理样品,功率30 W,每次3 min(超声5 s,停1 s),重复两次,直到得到接近透明的溶液.然后将上述溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤,得到空白FCC自组装纳米粒.取空白FCC纳米粒适量,用PBS配成质量浓度为2 mg/mL的稀释液.取纳米粒稀释液1 mL,向其中加入等体积不同质量浓度的盐酸阿霉素溶液(200、400、600、800 μg/mL),避光搅拌24 h,未被包载的阿霉素用超滤膜(截留分子质量为10 kD)除去,冻干后得到载药纳米粒.

1.4 载药纳米粒的形态观察及粒径测定

采用透射电镜(TEM,JEM-2100,Japan)观察载药纳米粒的形态[10].取纳米粒(m(药物)∶m(载体材料)=1∶10)适量,用PBS适当稀释,滴至覆有支持膜的铜网上,停留2 min,以滤纸吸去多余溶液,然后向铜网上滴加质量分数为2%的磷钨酸溶液负染色,用滤纸吸取多余溶液,自然干燥,然后用透射电镜观察粒子的形态.

采用激光粒度仪(Malvern Instruments,UK)测定纳米粒的粒径.取载药纳米粒(m(药物)∶m(载体材料)=1∶10)适量,用蒸馏水稀释至0.1 mg/mL,采用动态光散射法(DLS)测定.

1.5 包封率和载药量

阿霉素含量通过荧光法测定,检测波长490 nm.纳米粒的包封率(LE)和载药量(LC)通过如下式计算:

其中,A为溶液中阿霉素的总量;B为超滤后上清液中阿霉素的含量;C为冻干后纳米粒的质量.

1.6 体外释放特性

取3份10mg的DOX-FCC纳米粒(m(药物)∶m(载体材料)=1∶5),分别重新分散在pH值为7.4,6.8和5.0的PBS缓冲液中.将溶液装入透析袋(截留分子质量为14kD)中并分别置于含20mLpH值为7.4,6.8和5.0的PBS缓冲液的玻璃瓶中,在恒温37 ℃振荡箱中以100r/min进行释放.在预定的时间间隔,取出3mL透析液并补充加入相应pH的等量新鲜PBS溶液,阿霉素的含量用荧光法在480nm处测定,计算药物累积释放量.

2 结果和讨论

2.1FCC的合成及结构表征

FCC结构用HNMR表征,结果如图1所示.其中化学位移在3.0～4.5为CMCS分子中糖环基团的质子峰,化学位移7.8、7.4、7.2对应FA分子中-CONH-、苯环及-NH-的质子峰,化学位移2.3、1.8对应FA分子中H22和H21,这与文献报道[11]是一致的,结果表明,FA与CMCS成功连接.

图1 FCC的结构及核磁谱图

2.2 DOX-FCC纳米粒的理化性质

DOX-FCC纳米粒的形态如图2所示,TEM观察纳米粒呈球形,平均粒径在200 nm左右,在溶液中分散较好.DLS法测得的纳米粒粒径为232.5±18.2 nm,数值比TEM法大,主要是由于DLS法测得的数据为水化直径,而TEM法为脱水处理的直径,纳米粒体积缩小所致[12].

DOX-FCC纳米粒的包封率和载药量如表1所示.随着药物与载体材料的质量比的提高,纳米粒的载药量逐渐升高,从4.6%提高到18.9%,而包封率却逐渐降低,从90.3%降低到71.7%,说明过多的药物可能超出载体材料的包载能力,导致包封率下降.

图2 DOX-FCC纳米粒的形态(a)及粒径分布(b)

m(DOX)/mgLE/%LC/%0．290．3±0．54．6±0．10．484．6±0．68．5±0．20．677．5±0．813．4±0．20．871．7±0．418．9±0．2

2.3 药物体外释放

药物的体外释放见图3所示.由图可见,纳米粒具有明显的pH敏感释放特征.药物从纳米粒的释放都经历先突释后缓释的特征,突释由纳米粒表面吸附的药物引起,缓释则是药物从纳米粒内部扩散所致.随着pH值从7.4降低到5.0,药物从纳米粒中的释放速度明显加快,在pH值为7.4、6.8和5.0的释放介质中48 h累积释放量分别为27.5%、42.8%和66.9%.这可能是由于随着pH值降低,羧甲基壳聚糖的溶解性增强,纳米粒外层表面孔道增多,利于药物的释放.文献报道[13],肿瘤组织的pH值比正常组织更低,肿瘤组织间隙pH值一般在6.3～6.8,正常体液的pH值在7.4,而肿瘤细胞核内环境pH值一般在5.0～5.5.结合DOX-FCC纳米粒的释放特点可知,该纳米粒可以在正常组织及血液运输中减少药物释放而降低系统毒性,到达靶部位后加速释放,杀伤肿瘤细胞.

图3 DOX-FCC纳米粒在不同pH值的释放介质中48 h累积释放曲线

3 结 论

本文通过化学交联法将叶酸与羧甲基壳聚糖偶联,作为抗肿瘤药物阿霉素的载体,在水溶液中依靠聚合物分子相互作用自组装形成DOX-FCC纳米粒.该纳米粒对阿霉素包载率较高,可以靶向肿瘤细胞,而对正常组织细胞伤害较小.研究发现,DOX-FCC纳米粒具有明显的pH敏感释药特性,在偏酸性条件下释放较快而在中性条件下释放较慢,这更有利于提高药效而降低毒性.这种主动靶向肿瘤细胞的纳米药物载体为抗肿瘤药物的研发提供了新的思路.

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【责任编辑: 胡天慧】

Doxorubicin Loaded Folate Modified Carboxymethyl Chitosan Self-Assembled Nanoparticles and in Vitro Release

ZhangYan,LiChangming,QiRuiyan,ZhangMengru,LiDi

(Normal School, Shenyang University, Shenyang 110044, China)

Folate (FA) modified carboxymethyl chitosan (FCC) has been synthesized by chemical crosslinking method, and doxorubicin (DOX) loaded FCC nanoparticles (NPs) were prepared by self-assembly, which has the ability of targeting the tumor cells. Results showed that the nanoparticles were spherical and the particle size was about 200 nm. The drug loading content (DLC) and encapsulation efficiency (EE) were both affected by the adding DOX. The in vitro release showed that the NPs had a good pH-sensitive and sustained release for DOX. FA could enhance the DOX enrichment in the tumor cells, and reduce the toxicity for the normal tissues, which could improve the therapeutic effect of the tumor.

folate; carboxymethyl chitosan; doxorubicin; nanoparticle; self-assembly

2016-12-15

国家自然科学基金资助项目(81503014).

张 岩(1982-),男,辽宁沈阳人,沈阳大学讲师,博士.

2095-5456(2017)02-0087-04

R 318.08

A