补体C5基因单核苷酸多态性与肝细胞癌易感性关系的研究

廖建华， 李常灿， 王兆文

上海交通大学附属第一人民医院普外科，上海 200080

补体C5基因单核苷酸多态性与肝细胞癌易感性关系的研究

廖建华， 李常灿， 王兆文

上海交通大学附属第一人民医院普外科，上海 200080

目的 探讨中国华北地区乙型肝炎患者补体C5单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms, SNP)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)易感性的关系。方法 采用MassARRAY TM Analyzer技术平台进行C5 rs17611、rs25681及rs2300929 3个SNP的多态性基因型检测，并进行风险度分析、连锁不平衡及单倍型分析，探讨3个SNP与HCC易感性的关系。结果 与对照组比较，HCC组中rs17611位点等位基因G、rs25681位点等位基因C及rs2300929位点等位基因C可明显增加HCC的发病风险[P<0.05，OR(95%CI)>1]；单体型为rs17611G-rs25681C-rs2300929C可增加HCC发病风险(OR=3.708， 95%CI： 1.578～8.712)，单体型为rs17611A-rs25681T-rs2300929T可减少HCC的发病风险(OR=0.525， 95%CI： 0.303～0.909)。结论 C5 rs17611、rs25681及rs2300929 3个位点的基因多态性与HCC易感性有关，可作为筛查HCC好发的危险因素。

肝细胞癌；补体C5；单核苷酸多态性；易感性

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一，每年有近20万中国居民死于HCC[1]。目前的研究发现HCC的发生是一个多因素、多阶段的复杂过程，受环境和遗传因素影响。其中发现由于人群中两个等位基因的单个碱基变异造成的遗传学变异[单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms, SNP)]，不仅是遗传变异形式，而且与肝脏疾病发生和发展密切相关，可使个体对各种肝脏疾病产生不同的易感性[2]。

补体系统是人和动物体内参与各种微生物防御反应及免疫损伤性反应的一组具有酶活性的蛋白质，在免疫相关性疾病及肿瘤等各类疾病的发病机制中的关键作用已被广泛认可。由于肝脏是补体合成的主要场所(血浆中80%～90%的补体成分在肝细胞合成)，肝细胞也表达大量的补体受体，研究[3]表明肝脏疾病与补体激活相关。近年来大量的报道证实补体C5(complemente componente 5, C5)参与肺纤维化、肾纤维化及实体肿瘤的发病，且其基因多态性可能与丙型肝炎肝纤维化进展有关[4-7]。而目前国内外对HCC C5多态性的研究未见相关报道。本研究检测3个C5的功能SNP位点(rs17611、rs25681及rs2300929)多态性与中国人乙型肝炎后HCC易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007年3月-2012年6月在上海交通大学附属第一人民医院接受治疗的患者113例。乙型肝炎后HCC患者65例(HCC组)，男57例，女8例，平均年龄48.78岁;乙型肝炎肝硬化患者48例(对照组)，男37例，女11例，平均年龄45.29岁。HCC组患者均无其他部位恶性肿瘤史，未接受放疗、化学药物治疗。均为中国华北地区汉族人群。所有患者均留取血液标本，置于-80 ℃低温冰箱保存待检，所有患者临床血液检验结果均来自上海交通大学附属第一人民医院检验科。

1.2 DNA的提取和基因分型 采用AllPrep DNA/RNA Mini(Qiagen公司)试剂盒提取患者血液样本DNA。采用MassARRAY TM Analyzer技术平台(Sequenom公司)进行SNP检测和分型。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。计数资料比较采用χ2检验，等级资料比较采用非参数检验。计算两组的基因型、等位基因频率，使用χ2检验比较两间基因型频率、等位基因频率的分布差别。采用HAPLOVIEW 3.32软件(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)计算3个多态性位点间连锁不平衡系数(D′)并构建单倍体。应用Logistic计算OR值及95%CI。所有的统计检验均为双侧概率检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况比较 HCC组和对照组性别、民族构成和乙肝病毒感染比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组年龄比较差异有统计学意义(P=0.032)(见表1)。分析HCC组、对照组及全部患者组中C5的3个位点与临床Child-pugh评分的关系，各组中并未发现C5基因位点差异有统计学意义(P>0.05，见表2)。对C5基因的3个SNP进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，各位点均满足Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05，见表3)，即各组研究对象具有人群代表性。

表1 患者基本情况比较

Tab 1 Comparison of basic situation of patients

组别例数性别(男/女)年龄(≤50岁/>50岁)汉族乙肝病毒感染Child⁃Pugh评分(A/B/C)HCC组6557/836/29656538/24/3对照组4837/1136/12484818/18/12P值0．1360．032110．005

表2 两组患者C5位点与Child-Pugh评分的关系

Tab 2 Relationship between C5 locus and Child-Pugh score in two groups

病例组Child⁃Pugh评分(A/B/C)P值对照组Child⁃Pugh评分(A/B/C)P值rs17611GA+GG31/18/20．4446/10/80．088AA7/6/112/8/4rs25681CC+CT33/17/20．1035/11/70．064TT5/7/113/7/5rs2300929CC+CT16/13/20．2654/4/50．299TT22/11/114/14/7

2.2 rs17611、rs25681及rs2300929位点等位基因与HCC易感性的关系 rs17611、rs25618及rs2300929位点等位基因频率分布差异有统计学意义(P=0.003、P=0.004和0.019，见表2)。两组中rs17611的主要等位基因均为A(51.5%)、A(70.8%)；rs25681的主要等位基因为T(50.8%)、T(69.8%)；rs2300929的主要等位基因为T(72.3%)、T(85.4%)。经危险度分析法分析，rs17611位点等位基因G、rs25681位点等位基因C及rs2300929位点等位基因C与HCC的发病风险差异有统计学意义[OR(95%CI)>1,见表3]。

表3 rs17611、rs25681及rs2300929位点等位基因与HCC易感性分析[例数(%)]

Tab 3 The association between rs17611, rs25681 and rs2300929 SNPs with HCC susceptibility [n(%)]

基因位点HCC组P值对照组P值P∗值OR值(95%CI)rs17611G63(48．5)0．10528(29．2)0．5220．0032．284(1．306～3．992)A67(51．5)68(70．8)rs25618C64(49．2)0．06329(30．2)0．2680．0042．240(1．286～3．903)T66(50．8)67(69．8)rs2300929C36(27．7)0．99214(14．6)0．9810．0192．243(1．131～4．449)T94(72．3)82(85．4)

注：P值为Hardy-Weinberg平衡吻合度检验结果；P*值为χ2检验结果；OR(95%CI)为危险度分析法分析结果。

2.3 rs17611、rs25681及rs2300929位点基因型与HCC易感性的关系 基于等位基因频率分析结果，将rs17611(GA+GGvsAA)、rs25681(CC+CTvsTT)及rs2300929(CC+CTvsTT)位点的隐性模型进行下一步分析，3组模型差异均有统计学意义(P<0.05)。二分类Logistic回归分析显示，在校正年龄、性别影响后，携带rs17611等位基因G、rs25681等位基因C和rs2300929等位基因C者患HCC的危险性明显上升[P<0.05，OR(95%CI)>1,见表4]。

综上，rs17611位点基因型(GA、GG)、rs25681位点基因型(CC、CT)及rs2300929位点基因型(CC、CT)均与HCC发病风险相关，将其带入基因型联合分析(Kruskal-Wallis检验)，随着患者携带相关基因型的增加，其患HCC的可能性也增加(P<0.001)，携带不多于1个易感基因型的患者罹患HCC的危险性显著降低，携带3个易感基因型的患者罹患HCC的危险性明显增加(见表5)。

表4 rs17611、rs25681及rs2300929位点基因型与HCC易感性分析[例数(%)]

Tab 4 The association of rs17611, rs25681 and rs2300929 genotypes with HCC susceptibility [n(%)]

基因位点基因模型HCC组对照组P值P∗值OR(95%CI)rs17611GA+GG51(78．5)23(47．9)0．0010．0023．679(1．587～8．529)AA14(21．5)25(52．1)rs25681CC+CT52(80．0)23(47．9)<0．0010．0023．965(1．691～9．299)TT13(20．0)25(52．1)rs2300929CC+CT31(47．7)13(27．1)0．0260．0432．349(1．026～5．375)TT34(52．3)35(72．9)

注：P值为χ2检验结果；P*值代表调整性别和年龄后P值；OR(95%CI)为二分类Logistic回归分析结果。

表5 rs17611、rs25681及rs2300929位点易感基因型联合分析[例数(%)]

Tab 5 Combined effect of rs17611, rs25681 and rs2300929 genotypes[n(%)]

易感基因型个数HCC组对照组P值P∗值OR(95%CI)012(18．5)19(39．6)<0．0010．0130．346(0．147～0．811)11(1．5)7(14．6)0．0100．092(0．011～0．711)223(35．4)14(29．2)0．4861．330(0．595～2．971)329(44．6)8(16．7)0．0024．028(1．633～9．936)

注：P值为Kruskal-Wallis检验结果；P*值为χ2检验结果；OR(95%CI)为危险度分析法分析结果。

表6 rs17611、rs2300929及rs25681位点单倍体型分析

Tab 6 Haplotype analysis of rs17611, rs2300929 and rs25681

单倍体型病例组(频率)对照组(频率)P值OR(95%CI)ACC∗4．12(0．032)2．06(0．022)0．6903971．409(0．259～7．658)ACT∗0．00(0．000)3．61(0．039)0．022133-ATC0．00(0．000)1．03(0．011)--ATT∗62．88(0．484)58．30(0．634)0．0209140．525(0．303～0．909)GCC∗31．88(0．245)7．33(0．080)0．0016243．708(1．578～8．712)GTC∗28．00(0．215)16．57(0．180)0．5451571．232(0．626～2．425)GTT∗3．12(0．024)3．10(0．034)0．6568430．698(0．142～3．440)

注：*：有意义的单倍体型；单倍体型分析位点rs17611、rs2300929和rs25681；总χ2值为16.3802，df值为5(其中HCC组和对照组中频率<0.03的数据不做分析)；P值为0.005892。

3 讨论

SNP是人类可遗传的变异中最常见的，占所有多态性的90%以上[8]。目前，国内外学者对HCC发生发展机制、HCC手术及药物治疗方式、HCC术后复发等各方面与基因多态性相关性进行了广泛有效的研究[9-10]，尚不能完全解释HCC患者易感性、治疗效果和预后的个体差异性等特点。因此，完善HCC早期诊断、早期治疗是目前最有效的处理措施。有研究[6-7]表明补体C5基因多态性参与肝纤维化，并且发现在肿瘤发生、发展机制中C5具有特异的浓度相关性。本研究发现C5基因多态性与HCC易感性存在明显的关系。

C5是形成膜攻击复合体(MAC)的第1个补体分子。C5由以二硫键相连接的α、β链组成，其中α链为115 KDa，β链为75 KDa，没有链内硫酯键，分子量190 KDa。靠近N端的第74～75位精氨酸-亮氨酸键为C5转化酶作用的部位。在C5转化酶的作用下裂解出一个分子量为11 KDa的小片段C5a进入液相中。C5a是具有过敏毒素作用的补体裂解片段中作用最强的介质[11]。目前研究[12]表明高浓度的C5a可能通过增加外周血的Gr-1+CD11b+骨髓细胞，减少肿瘤表面的CD4+、CD8+T细胞，促进肿瘤血管的形成和抑制细胞凋亡来促进肿瘤生长。而低浓度的C5a通过刺激免疫细胞和阻断细胞周期来抑制肿瘤生长，或低浓度C5a可以刺激M1吞噬细胞和NK细胞到肿瘤表面，而M1吞噬细胞和NK细胞均有一定的抗肿瘤作用，从而表现为间接的抗肿瘤作用[12-14]。因此，C5a的肿瘤相关价值存在一定的浓度依赖性，存在于肿瘤表面的C5a浓度可能才是它表现出抑制或促进作用的关键。另外，也有报道[15]指出肿瘤表面表达的C5a受体能够明显加强肿瘤的侵袭力，且C5a刺激分泌的细胞因子，如肝细胞生长因子，也能增强肿瘤的侵袭力。

目前，C5与实质器官纤维化相关关系的研究已经在国内外广泛进行，Boor等[16]发现C5参与实质器官纤维化的机制可能与细胞表面表达的C5a受体、C5a刺激相关细胞因子和改变实质器官血流动力学相关,另一方面有研究[17]提出C5a与肝脏再生存在生物学关系。本研究纳入的3个位点均为目前C5基因中证实为有功能的SNP，研究[6]表明携带rs17611等位基因A者多为重度肝硬化患者，而携带rs2300929等位基因C者多为轻度肝硬化患者，论证了C5基因多态性与肝硬化过程存在明确的关系。另一方面，研究指出rs17611等位基因A及rs2300929等位基因T携带者的C5血清浓度相对于非携带者明显升高。C5的活力与C5基因多态性并未发现关系，这提示可能有其他影响C5活性的影响因子[5]。而rs25681位点的基因多态性也被证实与牙周炎易感性相关[18]。同以往研究一样，本研究也验证了纳入的3个位点间存在连锁不平衡，从而进行单体型分析以获得比单位点分析更多的遗传特异性。

本研究结果显示携带rs17611等位基因G、rs25681等位基因C和rs2300929等位基因C者患HCC的危险性明显上升，且单体型为rs17611G- rs25681C-rs2300929C可增加HCC发病风险。然而研究[5,12-14]表明rs17611等位基因G及rs2300929等位基因C携带者的C5血清浓度均相对于非携带者明显降低，而低浓度的C5a呈现了一定的抗肿瘤生长作用，这与本次研究存在明显差异。这可能是因为已报道的C5基因多态性与其血清浓度相关的研究中纳入的均为白种人(不)患丙肝患者，而本研究纳入的均为中国华北地区汉族乙肝患者，相同的基因位点因不同种群不同疾病而出现不同的临床表现型在多项临床基因研究中已经得到证实[19]。另外，Halangk等[20]在1 435例欧洲丙肝感染人群中并未发现C5基因多态性与肝硬化程度相关。这也表明基因多态性与临床表现型并不是一一对应关系，存在诸多影响因子。C5基因多态性如何影响其血清浓度仍未明确，C5a的肿瘤相关作用仍存在很多未知。

由于肝脏是补体合成的主要场所(血浆中80%～90%的补体成分在肝细胞合成)，肝星形细胞、枯否细胞、肝窦上皮细胞均表达C5a受体，这些客观条件明确了补体系统在肝脏疾病中的作用，本研究首次提出了C5基因多态性与HCC易感性的相关关系。今后可以在完善C5基因多态性与C5血清浓度相关关系及C5a血清浓度与HCC发病机制的研究前提下，在高危人群中开展筛查和随访，准确地评价个体发生HCC的危险性，从而达到早期防治HCC的目的。

在恶性肿瘤的防治措施中，早期排查、早期治疗，可以明显改善患者预后和生活质量，并且伴随着全基因组扫描技术、连锁分析、家系分析和SNP作为第3代遗传标记的广泛运用，我们可以逐步实现对恶性肿瘤或其他疾病的早期筛查，从而获得更好的临床效果。目前，C5a受体阻滞剂在实验中证实可明显减缓肝硬化的进程，并降低肝细胞中胶原蛋白的含量[6]。另外，含C5a的肿瘤疫苗可用于抑制肿瘤的生长[21]。因此，基于个体化早期治疗考虑，若能将本研究结果显示的C5基因多态性作为依据之一，可能更有助于研制相关生物制剂，阻断HCC的发展,有助于加强对HCC的防治，进一步降低高危患者的发病率，降低HCC患者的死亡率，改善患者的预后。

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(责任编辑：王全楚)

Relationship between polymorphism of complement C5 gene and susceptibility of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B

LIAO Jianhua, LI Changcan, WANG Zhaowen

Department of General Surgery, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200080, China

Objective To investigate the relationship between polymorphism of complement C5 gene and susceptibility of hepatocellular carcinoma (HCC) in patients with chronic hepatitise B. Methods Three single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in C5 were genotyped and analyzed by Mass ARRAY TM Analyzer, the association between C5 gene polymorphisms and susceptibility of HCC were explored. Results Compared with control group, the patients who harboring rs17611 allele G, rs25618 allele C and rs2300929 allele C could obviously increased the risk of HCC in the HCC group [P<0.05,OR(95%CI)>1]; haplotype rs17611G-rs25681C-rs2300929C notablely increased the risk of HCC incidence (OR=3.708, 95%CI: 1.578～8.712), otherwise, haplotype rs17611A-rs25681T-rs2300929T persisted as a beneficial factor for reducing the susceptibility of HCC (OR=0.525, 95%CI: 0.303～0.909). Conclusion C5 gene polymorphisms are associated with the susceptibility of HCC, and improves the predictive value of susceptible patients with HCC.

Hepatocellular carcinoma; Complement C5; Single-nucleotide polymorphisms; Susceptibility

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.04.009

国家自然科学基金资助项目(81370579)；上海市科学技术委员会基金资助项目(134119a6300)；上海交通大学“科技创新专项基金”资助项目(YG2012MS05)

廖建华，硕士研究生，住院医师，研究方向：肝脏肿瘤免疫治疗。E-mail: ljhtgcg@163.com

王兆文，博士研究生，副主任医师，研究方向：肝移植术后早期他克莫司代谢的影响及其机制的研究。E-mail: ljhsywzh@163.com

R735.7

A

1006-5709(2017)04-0395-05

2016-12-09