Arginase-1、Glypican-3、HepPar-1在肝细胞癌中的表达及意义

王 鹏,周新刚,滕晓英,张 亮,孙 磊,马志园

首都医科大学附属北京地坛医院病理科,北京 100015

Arginase-1、Glypican-3、HepPar-1在肝细胞癌中的表达及意义

王 鹏,周新刚,滕晓英,张 亮,孙 磊,马志园

首都医科大学附属北京地坛医院病理科,北京 100015

目的 研究肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝脏良性病变组织中精氨酸酶-1(arginase-1, Arg-1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3, GPC-3)、肝细胞抗原(Hep-1)的表达情况，探讨三种抗体及其他临床病理参数与肿瘤预后的相关性。方法 回顾性分析156例HCC患者及146例肝脏良性病变患者的临床病理特征，免疫组织化学方法检测三种抗体的表达，并结合HCC患者随访资料行临床病理学参数与预后关系分析。结果 Arg-1、GPC-3、Hep-1在HCC及肝脏良性病变中的表达率分别为93.6%(146/156)、90.4%(141/156)、85.3%(133/156)和97.3%(142/146)、3.4%(5/146)、98.6%(144/146)。单因素分析显示肿瘤直径、肿瘤多发、脉管癌栓、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)及Arg-1是影响HCC患者术后总体生存率的预后因素；多因素COX回归分析结果显示，肿瘤直径与脉管瘤栓是影响HCC患者术后总体生存率的独立预后因素。结论 联合应用Arg-1、GPC-3和Hep-1在HCC与肝脏良性结节性病变的鉴别诊断中具有重要意义。Arg-1可作为评估HCC患者预后的参考指标。

肝细胞癌; 精氨酸酶-1;磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3;肝细胞抗原-1

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤，而中国占全球新发病例和死亡病例的50%[1]。对HCC进行正确的病理诊断是给予治疗的前提和关键，但低分化HCC与转移性腺癌，尤其是低分化腺癌之间的鉴别，及高分化HCC同良性结节性病变的鉴别，一直是病理诊断的难点。

目前，应用于HCC的免疫标记物大致包括甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、多克隆癌胚抗原(polyclonal carcinoembryonic antigen, pCEA)、CD10、CD34、肝细胞抗原(HepPar-1,Hep-1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3, GPC-3)和精氨酸酶-1(arginase, Arg-1)，但前4种抗体的敏感性和特异性均不理想，对于诊断存在较大的局限性。GPC-3和Arg-1是近几年发现并应用于HCC的免疫标记物，具有更好的敏感性和特异性[2-3]。本文通过免疫组织化学染色检测HCC、肝脏良性病变组织中Arg-1、GPC-3 、Hep-1的表达，探讨三种抗体的敏感性、特异性，并对临床病理因素、三种抗体的表达与HCC患者生存相关性进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2009年1月-2014年6月在首都医科大学附属北京地坛医院行手术切除的HCC患者进行回顾性分析。选择有完整临床资料及随访信息的156例HCC患者入组，同时选择137例手术切除HCC患者癌旁肝组织、3例肝细胞腺瘤、6例局灶结节状增生(focal nodular hyperplasia, FNH)作为对照。

1.2 组织学检查及诊断标准 所有标本均经4%中性甲醛溶液固定，经梯度酒精脱水和二甲苯透明，石蜡包埋后连续切片，苏木素-伊红(HE)染色后封片。HCC及其他肿瘤诊断均参照最新版WHO标准进行，由2名高年资病理医师独自阅片。

1.3 主要抗体及试剂 抗Arg-1蛋白兔单克隆抗体(SP156)、抗GPC-3蛋白鼠单克隆抗体(1G12)和抗Hep-1蛋白鼠单克隆抗体(OCH1E5)均购自广州安必平医药科技股份有限公司。免疫组织化学染色采用超敏型二步法(第二代Polymer检测系统)，PV-9000通用型试剂盒、EDTA抗原修复液、柠檬酸盐抗原修复缓冲液(粉剂，0.01 mol/L，pH 6.0)、PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)、磷酸盐缓冲液(粉剂)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DAB显色剂购自Dako公司。

1.4 免疫组化判读 染色结果显示为棕黄色颗粒提示抗原阳性物，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；无阳性细胞为0分，阳性细胞数 ≤10%为1分，11%～50%为2分， 51%～75%为3分，>75%为4分。结果判断：两项得分相加结果≥2分为阳性，≤1分为阴性，其中0～1分为(-)，2～3分为(+)，4～5分为(++)，6～7分为(+++)。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17．0统计分析软件进行分析。计量资料采用独立样本t检验，计数资料组间比较采用χ2检验，采用Spearman相关系数进行相关性分析。收集患者生存时间与终点事件(死亡)，对生存时间采用Kaplan-Meier生存分析。多因素分析采用COX风险比例模型，以排除混杂因素获得独立的预后影响因素。所有分析均采用双侧，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理资料

2.1.1 临床资料：156例HCC患者中，男126例，女30例，男女发病年龄分别为(50.4±9.3)岁和(51.2±10.3)岁(P>0.05)。合并乙型肝炎病毒(HBV)患者148例(94.9%)；合并丙型肝炎病毒(HCV)患者4例(2.6%)；两种病毒检测均阴性者4例(2.6%)。临床生化结果详见表1。3例肝细胞腺瘤患者均为女性，年龄分别为29岁、31岁和35岁。6例FNH患者中，男2例，女4例，年龄(38.8±7.3)岁(17～56岁)。

2.1.2 大体及组织学情况：肿瘤单发138例(88.5%)，多发18例(11.5%)。肿瘤直径0.8～14.0 cm，平均(3.4±2.2)cm。肿瘤分化程度：高分化者11例(7.1%)、中分化者110例(70.5%)及低分化者35例(22.4%)。可见脉管内癌栓者57例(36.5%)，未见脉管内癌栓者99例(63.5%)。肝硬化情况：无肝硬化者19例(12.2%)、早期肝硬化者13例(8.3%)及肝硬化者124例(79.5%)。

表1 156例HCC患者临床病理数据

Tab 1 Clinical pathological data of 156 cases of HCC patients

一般情况检测值性别(男/女)126/30年龄(岁)50．5±9．5(28～80)病毒感染(乙肝/丙肝/无)148/4/4生化指标 AFP(ng/ml)127．6±144．1(0．9～431．1) ALT/AST(U/L)55．1±113．0(9．5～1210．9)/56．7±159．9(12．1～1877．1) TB/DB(μmol/L)16．6±8．7(4．5～52．2)/6．2±4．3(1．1～30．6) TP/ALB/G(g/L)68．5±6．9(42．1～85．3)/39．1±4．7(25．2～51．0)/29．5±4．9(15．4～45．8) GGT/ALP(U/L)55．5±48．6(6．5～281．1)/80．2±28．1(18．0～211．7)

注：AFP:甲胎蛋白，ALT:谷丙转氨酶，AST:谷草转氨酶，TB:总胆红素，DB:直接胆红素，TP:总蛋白，ALB:白蛋白，G:球蛋白，GGT:γ-谷氨酰转肽酶，ALP:碱性磷酸酶。

2.2 生存时间分析 156例HCC患者全部纳入随访。随访时间19～83个月。本组HCC患者中位生存时间为53.1个月，术后1年生存率、3年生存率和5年生存率分别为86%、64%和46%(见图1)。单因素分析显示，肿瘤直径(P=0.000)、肿瘤多发(P=0.001)、有脉管内癌栓(P=0.000)、ALT(P=0.022)、AST(P=0.003)及ALB(P=0.031)均为预后差的因素，而性别(P=0.268)、年龄(P=0.132)、分化程度 (P=0.179)、有无合并肝硬化(P=0.320)及HBV(P=0.450)感染状态及其他生化指标则与预后无明显关系，其他生化指标分别为： AFP(P=0.396)、TB(P=0.873)、DB(P=0.398)、TP(P=0.275)、G(P=0.538)、GGT(P=0.552)、ALP(P=0.763)。

2.3 免疫组织化学染色定位 Arg-1的阳性部位为胞质及胞核，表达主要形式为弥漫胞质阳性(78.1%, 114/146)或胞质及胞核同时阳性(17.8%, 26/146)，单独胞核阳性的比例很低(4.1%, 6/146)；GPC-3的阳性部位为胞质及胞膜，主要表达形式为弥漫胞质阳性(66.0%，93/141)或胞质及胞膜同时阳性(31.9%, 45/141)，单独胞膜阳性的比例很低(2.1%, 3/141)；Hep-1阳性部位为胞质(见图2)。

图1 156例HCC患者术后生存曲线

图2 HCC组织中Arg-1、GPC-3、Hep-1的免疫组织化学染色(超敏型二步法) A：Arg-1在胞质内呈弥漫强阳性表达(200×)；B：Arg-1在胞质和胞核内呈弥漫强阳性表达(400×)；C：Arg-1在部分胞核内呈中等强度阳性表达(400×)；D：GPC-3在胞浆内呈弥漫强阳性表达(200×)；E：GPC-3在胞浆和胞膜内呈弥漫强阳性表达(400×)；F：Hep-1在胞浆内呈弥漫强阳性表达(200×)

Fig 2 Expressions of Arg-1, GPC-3 and Hep-1 in HCC tissue A: Arg-1 was diffuse strong positive in cell cytoplasm (200×); B: Arg-1 was diffuse strong positive in cell cytoplasm and nucleus (400×); C: Arg-1 was moderate positive in nucleus (400×); D: GPC-3 was diffuse strong positive in cell cytoplasm (200×); E: GPC-3 was diffuse strong positive in cell cytoplasm and membrane (400×); F: Hep-1 was diffuse strong positive in cell cytoplasm (200×)

2.4 三种蛋白在不同组织中的阳性表达 Arg-1在HCC中的阳性表达率为93.6%(146/156)，在肝脏良性病变中的阳性表达率为97.3%(142/146)。GPC-3在HCC中的阳性表达率为90.4%(141/156)，在肝脏良性病变中的阳性表达率仅为3.4%(5/146)。Hep-1在HCC中的阳性表达率为85.3%(133/156)，在肝脏良性病变中的阳性表达率为98.6%(144/146)。HCC中Arg-1和GPC-3的阳性表达率显著高于Hep-1(P=0.031)；肝脏良性病变中Arg-1和Hep-1的阳性表达率显著高于GPC-3(P=0.000，见表2)。

2.5 三种蛋白在不同分化HCC中的表达 Arg-1在高、中、低分化HCC中的阳性表达率分别为100%(11/11)、97.3%(107/110)、80.0%(28/35),即肿瘤分化越差其阳性表达率越低(R=-0.264，P=0.001)。GPC-3在高、中、低分化HCC中的阳性表达率分别为72.7%(8/11)、90.9%(100/110)、94.3%(33/35)，即肿瘤分化越差其阳性表达率越高(R=0.179，P=0.026)。Hep-1在高、中、低分化HCC中的阳性表达率分别为100%(11/11)、86.4%(95/110)、77.1%(27/35)，其阳性表达率与肿瘤分化的关系同Arg-1相似，即肿瘤分化越差其阳性表达率越低(R=-0.161，P=0.047)。

2.6 三种蛋白在肝脏恶性肿瘤及良性病变中的敏感性及特异性 Arg-1、GPC-3及Hep-1的敏感性分别为93.6%(146/156)、90.4%(141/156)、85.3%(133/156)。对于肝脏恶性肿瘤与肝脏良性病变的鉴别，Arg-1与Hep-1几乎无特异性，分别为2.7%(4/146)、1.4%(2/146)，而GPC-3的特异性高达96.6%(141/146)。

2.7 三种蛋白与生存期相关性分析 单因素分析显示，Arg-1的阳性表达与预后具有显著相关性(P=0.046)，即Arg-1的阳性表达越强，提示该患者的预后越好；而GPC-3(P=0.146)和Hep-1(P=0.119)的阳性表达与预后无显著相关性。COX风险比例模型多因素分析显示，肿瘤直径与脉管瘤栓为影响HCC患者生存期的独立因素，Arg-1的表达不能作为指导HCC患者预后的独立因素。

表2 HCC及其他组织中Arg-1、GPC-3、Hep-1的表达

Tab 2 Expressions of Arg-1, GPC-3 and Hep-1 in HCC and other tissues

肿瘤类型Arg⁃1-++++++GPC⁃3-++++++Hep⁃1-++++++总例数HCC 高分化01463323022711 中分化386534101931501574345110 低分化751492410198217835HCC癌旁组织3771201343002412119137肝细胞腺瘤0012210000213FNH1014510000066

表3 COX多因素分析

Tab 3 COX multivariate regression analysis

变量B值S．E．值P值Exp(B)95%CI肿瘤直径0．1390．0560．0141．1491．029～1．283肿瘤多发0．1420．2890．6231．1630．654～2．031脉管瘤栓0．6960．2560．0072．0061．213～3．316ALT-0．0030．0040．4290．9970．988～1．005AST0．0030．0030．2741．0030．997～1．009ALB-0．0410．0280．1430．9600．908～1．014Arg⁃1-0．0210．1470．8890．9800．735～1．306

3 讨论

对HCC进行正确的病理诊断是给予患者治疗的前提和关键，但低分化HCC与转移性低分化腺癌之间的鉴别及高分化HCC同良性结节性病变的鉴别，均是病理诊断的难点。Arg-1是最近几年发现并应用于HCC中，敏感性和特异性最佳的免疫标记物[2-3]，尤其是与GPC-3和Hep-1联合应用进行肝脏来源的恶性肿瘤的鉴别。本文通过免疫组织化学染色检测HCC、HCC癌旁组织、肝细胞腺瘤及FNH中Arg-1、GPC-3、Hep-1的表达，探讨了三种抗体对HCC与肝脏良性结节性病变的敏感性及特异性，并通过单因素及多因素分析，结合患者随访资料行临床病理学参数与预后关系分析。

Arg-1作为目前最敏感的HCC标记物，国内外报道的阳性表达率为75.5%～100%[2-7]，其中，成琳等[4]研究了49例HCC标本，37例Arg-1阳性，其75.5%的阳性表达率是目前国内外研究中Arg-1表达率最低的报道；而Geramizadeh等[5]研究43例HCC标本中，Arg-1全部为阳性，100%的阳性表达率是目前国内外研究中Arg-1表达率最高的报道。两组研究的共同特点是入组样本数量较小，可能产生一定的抽样误差。本研究结果显示，Arg-1在HCC中的阳性表达率为93.6%，表达主要形式为弥漫胞质阳性或胞质及胞核同时阳性，单独胞核阳性的比例很低。同时，Arg-1在高、中、低分化HCC中的阳性表达率分别为100%、97.3%、80.0%，其阳性表达率随着肿瘤分化程度的降低而降低，这与Yan等[2]、Fujiwara等[7]报道一致。

国内外报道的GPC-3在HCC中阳性表达率为49%～97.7%[3-9]。其中阳性率最低的报道出自Anatelli等[8]研究组，74例HCC标本中仅36例表达GPC-3；而阳性率最高的报道出自Geramizadeh等[5]研究组，43例HCC标本中42例表达GPC-3。本研究结果显示，GPC-3在HCC中的阳性表达率为90.4%，主要表达形式为弥漫胞质阳性或胞质及胞膜同时阳性，单独胞膜阳性的比例很低。同时，GPC-3在高、中、低分化HCC中的阳性表达率分别为72.7%、90.9%、94.3%，与Fujiwara等[7]报道不同的是，我们的研究显示GPC-3阳性表达率随着肿瘤分化程度的降低而升高，其表达在不同分化肿瘤中具有显著性差异。

Hep-1是三种抗体中最早应用于临床研究的免疫标记物，于1993年Wennerberg以石蜡包埋的肝组织内线粒体作为抗原克隆出的一种抗体，其在HCC中的阳性表达率为49%～100%[4,10]。本研究结果显示，Hep-1在HCC中的阳性表达率为85.3%，表达形式全部为胞质阳性。其在高、中、低分化HCC中的阳性表达率分别为100%、86.4%、77.1%，与肿瘤分化的关系同Arg-1相似。

我们结合对肝脏良性病变中三种抗体的检测，分析了Arg-1、GPC-3和Hep-1在HCC与肝脏良性病变中的敏感性与特异性，结果显示，Arg-1的敏感性最高，而GPC-3的特异性最高。由于肝细胞中高度表达Arg-1和Hep-1，故在肝脏良性病变与HCC的鉴别中，其特异性很低。联合三种抗体的使用，对于病变的鉴别诊断更有意义。

本组HCC患者术后1年、3年和5年总体生存率略高于高文斌等[11]报道88.1%、60.2%和41.7%。这种差异可能来自于病例收集的时间、地区的差异，且本组HCC患者中早期HCC患者占63.5%(99/156)。全球范围内，手术治疗HCC患者的5年总体生存率为40%～70%[12]。研究[13]报道显示血管侵犯、HCC细胞分化程度差、肝硬化、肿瘤最大径等临床病理因素都是HCC术后长期生存不良的预测因素。本研究不仅分析了临床病理因素的预后相关性，而且对临床生化因素及三种免疫标记物进行了单因素及多因素生存相关性分析。单因素分析结果显示，肿瘤直径、肿瘤多发、脉管癌栓、ALT、AST、ALB及Arg-1为影响HCC患者术后总体生存率的预后因素；多因素COX回归分析结果显示，肿瘤直径与脉管瘤栓是影响HCC患者术后总体生存率的独立预后因素。虽然Arg-1不能作为影响HCC患者术后总体生存率的独立预后因素，但可作为评估患者预后的参考指标，这个结果也验证了顾春燕等[14]的推断，其研究结果显示HCC中Arg-1表达降低，并与HCC分化、转移及复发呈显著相关性。

总之，联合应用Arg-1、GPC-3和Hep-1在HCC的诊断与鉴别诊断中具有重要意义,尤其在肝脏恶性肿瘤与良性结节性病变的鉴别诊断中，GPC的高特异性可以有效弥补Arg-1和Hep-1的染色缺憾。同时，Arg-1可作为评估HCC患者预后的参考指标。

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(责任编辑：王全楚)

Expressions and significance of Arginase-1, Glypican-3 and HepPar-1 in hepatocellular carcinoma

WANG Peng, ZHOU Xingang, TENG Xiaoying, ZHANG Liang, SUN Lei, MA Zhiyuan

Department of Pathology, Beijing Ditan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100015, China

Objective To evaluate the expressions of arginase-1 (Arg-1), glypican-3 (GPC-3) and hepatocyte paraffin antigen-1 (Hep-1) in hepatocellular carcinoma (HCC) and benign liver lesions, and to investigate the correlation between three kinds of antibodies and other clinical pathological parameters with prognosis of the tumor.Methods Expressions of three kinds of antibodies in 156 cases of HCC patients and 146 cases of benign liver lesions were detected by immunohistochemistry. The correlation between clinicopathological features and the prognosis was analyzed according to the follow-up material.Results The positive expression rates of Arg-1, GPC-3, Hep-1 in HCC and benign liver lesions were 93.6%(146/156), 90.4%(141/156), 85.3%(133/156) and 97.3%(142/146), 3.4%(5/146), 98.6%(144/146), respectively. Univariate analysis showed that tumor diameter, tumor multiple, vascular tumor thrombus, ALT, AST, ALB and Arg-1 were prognostic factors for the overall survival rate of patients with HCC. The COX regression analysis showed that the independent risk factors for the overall survival rate were tumor diameter and vascular tumor thrombus.Conclusion The combination of Arg-1, GPC-3 and Hep-1 in the differential diagnosis of HCC and benign liver lesions has great significance. Arg-1 can be used as a reference index for evaluating the prognosis of HCC patients.

Hepatocellular carcinoma; Arginase-1; Glypican-3; HepPar-1

王鹏，博士，副主任医师。研究方向:消化病理、血液病理、细胞病理。E-mail:chinaroc001@126.com

周新刚，研究方向：消化病理。E-mail:zhouxg1980@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.04.008

R735.7

A

1006-5709(2017)04-0390-05

2017-1-26