纸层析法分离鉴定氨基酸实验的改进

陈倩刘晶张璐

（1西北大学现代学院，陕西 西安 710130 2西安外事学院，陕西 西安710077）

纸层析法分离鉴定氨基酸实验的改进

陈倩1刘晶2张璐1

（1西北大学现代学院，陕西 西安 710130 2西安外事学院，陕西 西安710077）

1 仪器与试剂

仪器：定性滤纸，点样毛细管，电吹风，500 mL烧杯，培养皿，镊子。

试剂：各种试剂均为分析纯。

氨基酸标准溶液：称取氨基酸250 mg溶于50 mL 0.01 mol.L-1的HCl溶液中

氨基酸混合样品液：各量取2mL的赖氨酸溶液，苯丙氨酸溶液，甘氨酸溶液，脯氨酸溶液和亮氨酸溶液，于小烧杯中充分混合均匀。

扩展剂：95%乙醇:水=7:3（v:v），称取茚三酮200 mg溶于

200 mL按比例配置好的乙醇水溶液中。

茚三酮可溶于乙醇和水，因此直接将茚三酮溶解在展层剂中，扩展剂沿滤纸向上移动，茚三酮也随之向上移动，层析结束后，溶剂前沿以下的部分均匀分布着扩展剂和茚三酮，氨基酸则因分配系数的不同而在纸上分离，加热后在氨基酸所在位置即可显出色斑。

2 实验步骤

（1）点样：取滤纸（定性滤纸裁成7.2×11cm）1张，距一端2cm处用铅笔轻轻的划线，然后在线上分别用0.5%赖氨酸、

0.5 %苯丙氨酸、0.5%甘氨酸、0.5%亮氨酸溶液、0.5%脯氨酸溶液及氨基酸混合样品溶液均匀点样，每点点2-3次，每次点样完成后用吹风机冷风吹干，每点在纸上扩散的直径最大不超过5 mm。

（2）展层：烧杯中加入配好的展层剂厚度约1.5 cm（体积约50 mL），将点好样的滤纸竖直放入，点样端朝下，展层时间2 h。

（3）烘干、显色：展层结束后，取出滤纸，用铅笔标记溶剂前沿，电吹风热风吹干约2-3 min。待各斑点显色后，用铅笔轻轻描出斑点轮廓。

（4）标记斑点中心，用直尺测量斑点中心至点样线间的距离及溶剂前沿至点样线间的距离。计算各点比移值。

图1 纸层析结果

3 结果和讨论

3.1 结果分析(见图1)

1.0.5 %赖氨酸溶液2.0.5%苯丙氨酸溶液3.0.5%甘氨酸溶液

4.0.5 %亮氨酸溶液5.0.5%脯氨酸溶液6.氨基酸混合液

说明：该图为实验后隔天拍摄，斑点轮廓已扩散。

赖氨酸 Rf1=1.0/7.1=0.14（文献[1]值：0.03）

苯丙氨酸 Rf2=4.7/7.1=0.66（文献[1]值：0.63）甘氨酸 Rf3=2.7/7.1=0.38（文献[1]值：0.43）亮氨酸 Rf4=5.7/7.1=0.80（文献[1]值：0.61）脯氨酸 Rf5=4.4/7.1=0.62（文献[1]值：0.35）混合液中各点的比移值：

A点的Rf=1.0/7.1=0.14与赖氨酸比移值相同B点的Rf=2.6/7.1=0.37与甘氨酸比移值相近C点的Rf=4.8/7.1=0.68与苯丙氨酸比移值相近D点的Rf=5.8/7.1=0.82与亮氨酸比移值相近判断氨基酸混合液中可能含有赖氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，亮氨酸。

各氨基酸比移值与文献值不同，应是使用的滤纸性质差异引起的。

3.2 改进后的优点

(1)提高分离效果，显色均匀，色斑清晰。以往向滤纸上喷布茚三酮溶液的操作，由于雾滴分布不均，容易出现色斑显色不均，甚至被冲散的现象，不易判断斑点中心，影响氨基酸Rf值，改进后的方法解决了这一问题。

(2)简化操作步骤，节省大量仪器设备，节约实验时间。准备时不用单独配制显色液，不用准备烘箱，喉头喷雾器，层析缸，针线等仪器设备。本实验使用滤纸大小为7.2cm*11cm（文献[1]中为28cm*28cm），滤纸使用量明显减少。操作中省去了喷布茚三酮溶液的操作步骤和层析缸内溶剂平衡的步骤，大大节省了实验时间，使操作更加简便易行。

(3)节省试剂，节约实验成本。原方法将显色剂茚三酮配成

0.5 %的浓度，而本方法改进后将其配成0.1%，减少了茚三酮用量。

(4)避免使用刺激性气味较大、水溶性较差的正丁醇，避免使用毒性和腐蚀性较大的苯酚，改用能与水任意比例互溶的乙醇，使得展开剂体系更均一，展开效果更好。采用毒性较小的溶剂代替原有毒性较大的溶剂，符合绿色化学的要求。

[1]陈雅蕙等[M]生物化学实验原理和方法(第二版)，北京大学出版社，2005.8：222-223；

[2]田明，高峥，苏英华等，氨基酸纸层析实验的进一步探讨[J]实验室科学，2009（6）：64。

Improvement of Separation and
Identification of Amino Acids by Paper
Chromatography

Chen Qian，Liu Jing，Zhang Lu
(Modern College of Northwest University，Xi’an 710130，China Xi'an International University，Xi’an 710077，China)

纸层析法分离鉴定氨基酸是制药工程专业本科必修实验课，文献实验方法存在实验时间过长、溶剂毒性大等缺点。通过实验对展开剂进行选择,得出展开剂的最佳配比，并在此条件下对赖氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸和脯氨酸等进行了分离和鉴定,取得了较好的分离结果。该方法与文献相比，简化操作步骤，节约仪器试剂，节省实验时间，使用毒性较小的溶剂，符合绿色化学的要求。

纸层析法；氨基酸；比移值；绿色实验

The paper chromatography separation of amino ac⁃ids is a compulsory biological experiment for undergraduate major in pharmaceutical engineering.But some shortcomings,such as a long duration，toxicity of the solvent,exist in this experiment. This study conducted the influence factors，obtained the best ratio of the expansion agent.We isolated and identified lysine,phenylal⁃anine,glycine,leucine and proline under this condition.It showed a better separation effect.Compared with the method in literature, the improved paper chromatography has the advantage of more simple steps,less agent dose and instrument,shorter separate time，more obvious separate effect,less toxic solvents,which conforms to the green chemistry request.

Paper chromatography；Amino acid；Rf Value；Green experiment

陈倩（1986-），女，陕西杨凌人，西北大学现代学院教师，主要研究方向：化工与制药（药物合成）。