富勒烯对大型蚤的急性毒性和慢性毒性效应

黄勃铭，吕小慧，王秋丽，朱小山，周进，蔡中华

（1.清华大学环境学院，北京 100084；2.清华大学深圳研究生院，广东 深圳 518000；3.哈尔滨工业大学深圳研究生院，广东 深圳 518000；4.辽宁省环境监测实验中心，沈阳 110161）

富勒烯对大型蚤的急性毒性和慢性毒性效应

黄勃铭1，2，吕小慧2，3，王秋丽4，朱小山2*，周进2，蔡中华2

（1.清华大学环境学院，北京 100084；2.清华大学深圳研究生院，广东 深圳 518000；3.哈尔滨工业大学深圳研究生院，广东 深圳 518000；4.辽宁省环境监测实验中心，沈阳 110161）

为深入理解富勒烯（Fullerene，nC60）的水生生态毒理效应，以模式动物大型蚤（Daphnia magna）为研究对象，研究nC60对大型蚤的48 h和72 h急性毒性效应以及21 d慢性毒性效应。结果表明，急性暴露下，nC60对大型蚤的48 h半抑制浓度（EC50）和半致死浓度（LC50）分别为25.3 mg·L-1和28.5 mg·L-1，72 h的EC50和LC50分别为14.9 mg·L-1和16.3 mg·L-1，且大型蚤的跳跃频率和心跳频率随着在nC60中暴露时间的延长先增加后减少；慢性暴露下，1 mg·L-1的nC60即可对大型蚤的繁殖产生影响，21 d内总产蚤数和平均产蚤数分别为53.3个和0.3个，与对照相比明显降低。研究结果表明，无论急性还是慢性暴露下，nC60均显著抑制大型蚤的生长和繁殖，其水生生态毒性不容忽视。

大型蚤；nC60；急性毒性；慢性毒性

富勒烯（nC60）作为一种典型的人工纳米材料，以其优良的性质，被人们越来越多地利用，相关产品遍布人类生产、生活的方方面面[1]。尽管人们对nC60和其他纳米材料应用的研究日益丰富、宽泛，但对它们的毒理学和环境效应所知甚少。大量证据表明nC60会对人类细胞、细菌和动物产生毒害[2-4]，毒性影响包括改变革兰氏阴性菌和阳性菌细胞膜组分，引起细胞死亡等[5-6]。此外，nC60引起人类淋巴细胞的DNA损伤和小鼠肺毒性也已被科学家证实。然而，关于nC60对水环境生态效应的研究目前仍较少。

大型蚤是水生浮游动物的代表，是连接水生食物链的重要中间体，对净化水体有重要作用，其初级生产量直接影响水生生态系统的结构和功能[7-8]。由于大型蚤具有的普遍性、敏感性和生命周期短等特点，使其成为国内外水生生物毒理学研究的标准测试生物，广泛用于水生生物风险评估测试。目前，国内外学者对nC60的水生态毒理学做了初步研究。Tao等[9]对出生24 h的幼蚤进行急性毒性实验，结果表明nC60暴露48 h的LC50为0.44 mg·L-1，在极低的浓度即产生明显急性毒性；其实验还发现延长暴露时间不仅对母蚤产生毒性，而且对其后代产生不利影响。Tervonen等[10]研究了不同浓度下大型蚤对nC60的生物富集情况，发现在不同暴露浓度下nC60均能被大型蚤迅速摄入，却很难被排出体外，这使得nC60在肠道内形成大量累积。Tao等[11]还发现斜生栅藻长期暴露在nC60中，其叶绿素含量减少，光合作用受到抑制，从而使多糖、蛋白和脂质等光合产物的合成量降低。Britto等[12]发现在紫外光照射下，nC60和低浓度藻毒素（50 μg· L-1）共同作用会使锦鲤的抗氧化能力受到损伤。nC60与现有污染物的联合毒性不容忽视。另外，nC60长期暴露对大型蚤所产生的慢性毒性效应仍不清楚。

本文较为全面地考察了nC60对大型蚤的急性和慢性毒性，分别从抑制率、死亡率、跳跃频率和心跳频率等方面展开对急性毒性的研究，从21 d的总产蚤量和日产蚤量两方面对慢性毒性进行评估，旨在为评估nC60的水环境风险提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验生物

模式生物大型蚤由南开大学赠送，体长为（3.7± 0.2）mm，并按照Tao等[13]方法进行培养。培养温度为（21±1）℃，溶解氧为6 mg·L-1，光暗周期16 h/8 h，每天定时投喂斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）。斜生栅藻的培养参照赵丽红[14]的方法。

1.2 实验试剂

nC60购于南京先丰纳米材料有限公司，杂质包含C70、C60的氧化物，以及微量溶剂和极少量高富勒烯，纯度大于99.5%。其余试剂均为国产优级纯或分析纯，纯度均高于99.0%。玻璃仪器在使用前均用10.0%浓硝酸浸泡48 h，并用去离子水冲洗干净。

1.3 储备液的制备

试验体系是曝气3 d的自来水，pH 7.4，总有机碳（TOC）为1.6 mg·L-1，水中Ti、Cu、Cd和Pb的质量浓度分别为0、60、70、9 ng·L-1（ICP-MS）。取20 mg nC60溶于100 mL曝气3 d的自来水中，连续超声24 h，直至形成橙黄色液体，然后配成200 mg·L-1的nC60储备液待用[15]。用曝气3 d的自来水稀释nC60储备液，分别制备5、20、40 mg·L-1的nC60悬浮液待用，现用现配。

1.4 实验方法

1.4.1 急性毒性实验

配备浓度为0、1、5、10、20、40 mg·L-1的悬浮液200 mL，在100 mL小烧杯中分别加入各个浓度悬浮液50 mL，每个烧杯加入10头大型蚤（蚤龄5 d）。每个浓度设置3个平行样，静水放置72 h。大型蚤活动抑制和死亡的判断标准如下：反复转动烧杯，15 s内失去活动能力即视为活动抑制；将大型蚤在显微镜下观察，心脏停止跳动即视为死亡。每24 h观察抑制数和死亡数[8]。另外，分别在0、2、4、8、12、24、48、72 h时将1头蚤依次转入装有10 mL对应浓度的悬浮液的比色管中，肉眼计数其在30 s内的跳跃次数，每头蚤数2次，共数5头，求取平均跳跃频率[10]。在上述相同暴露时间下，取3头蚤依次在光学显微镜下观察其心跳并拍摄视频，计数其在30 s内的心跳次数，计算平均心跳频率[10]。

1.4.2 慢性毒性实验

实验单元为100 mL的烧杯内含50 mL的nC60水溶液。实验设置0、0.1、1.0 mg·L-1三个浓度处理组，每个浓度组设置三个平行。每个实验单元包含10头7 d蚤龄的大型蚤，每天计数新生小蚤的个数，并将小蚤从实验单元分离后更换暴露液。大型蚤每天以斜生栅藻喂食，并保证暴露液中藻细胞浓度为2×104个· mL-1，持续记录21 d后，计算每头成蚤21 d内的日均产蚤数。为确保水的质量，每4 d对水的温度、溶解氧、pH、电导率和碱度进行监测。

1.5 数据分析

采用EPA提供的专业软件Probit计算nC60对大型蚤的48 h和72 h的EC50和LC50，采用SPSS对数据进行方差分析（One Way ANOVA）及Turkey′s Test分析，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 急性毒性实验

如图1和图2所示，大型蚤的抑制数和死亡数随着nC60浓度的增加而增加，对于蚤龄为5 d的大型蚤，nC60对其的48 h和72 h的EC50和LC50如表1所示。与暴露48 h相比，nC60对大型蚤的72 h EC50和LC50值均显著降低，表明暴露时间越长，nC60对大型蚤的毒性越强，说明暴露时间对于评价污染物毒性具有关键性作用。

图1 nC60对大型蚤的活动抑制Figure1 Immobilization of D.magna after exposure to nC60

图2 nC60对大型蚤的致死率Figure 2 Mortality of D.magna after exposure to nC60

表1 nC60对大型蚤的EC50和LC50Table 1 EC50and LC50of nC60to D.magna

如图3所示，单一浓度组在实验开始的阶段，大型蚤的跳跃频率不断增加，与暴露时间呈正相关；但是随着暴露时间的延长，大型蚤的跳跃频率逐渐降低，游动变得迟缓。对于不同的浓度组，大型蚤跳跃频率的变化趋势基本相同，只是跳跃频率的峰值和达到峰值的时间有所不同：0、1、5、10、20、40 mg·L－1浓度组在实验结束时的跳跃频率分别为116、116、105、71、22、0次·min－1，跳跃频率分别在暴露48、24、12、8、2、2 h达到峰值，分别为124、154、156、152、152、142次·min－1。

图3 nC60对大型蚤跳跃频率影响Figure 3 Effect of nC60on hop frenquency of D.magna

如图4所示，对于单一浓度组在实验开始的阶段，大型蚤的心跳频率不断增加，与暴露时间呈正相关；但是随着暴露时间的延长，大型蚤的心跳频率逐渐降低。对于不同的浓度组，大型蚤跳跃频率的变化趋势基本相同，但实验结束时的心跳频率、达到峰值的时间和峰值有所不同：0、1、5、10、20、40 mg·L－1浓度组的心跳频率分别在暴露48、12、8、8、4、4 h达到峰值，分别为150、200、198、219、204、220次·min-1。

图4 nC60对大型蚤心跳频率影响Figure 4 Effect of nC60on heartbeat frenquency of D.magna

2.2 慢性毒性实验

如表2所示，大型蚤暴露于nC6021 d后，0.1 mg· L-1浓度组中大型蚤的总产蚤数下降，1.0 mg·L-1浓度组中大型蚤的平均产蚤数和总产蚤数均显著下降，且在暴露5 d后，出现大型蚤死亡现象。21 d慢性实验表明，nC60在较低浓度下（1 mg·L-1）仍能对大型蚤产生明显毒性效应，再一次说明暴露时间对评价毒物毒性的关键性。

表2 nC60对大型蚤的21 d慢性毒性Table 2 21d chronic toxicity of nC60to Daphnia magna

3 讨论

本实验测定了自来水体系中TOC和几种主要有毒金属的含量，结果表明其浓度都很低，不会对大型蚤急性和慢性毒性实验产生影响。

急性毒性是评价污染物毒性的基本指标。本研究中nC60对蚤龄为5 d的大型蚤48 h的EC50和LC50分别为25.3 mg·L-1和28.5 mg·L-1，Tao等[9]和Zhu等[16]研究表明nC60对大型蚤48 h的LC50分别为0.4 mg· L-1和0.8 mg·L-1。实验结果的差异可能与大型蚤的蚤龄有关（后者所用蚤均为蚤龄小于24 h的幼蚤），也可能与储备液的制备方法有关。传统的急性毒性实验一般将暴露时间设置为48 h，但由于nC60在大型蚤体内的高度累积，本实验将暴露时间延长至72 h，以探究nC60的毒性指标是否出现明显变化。实验结果显示其72 h的EC50和LC50都出现显著降低，表明将暴露时间延长至72 h也许对评估nC60的毒性更有意义。慢性毒性是评价污染物长期毒性的指标。在本研究中，1 mg·L-1浓度的nC60短时间内并未对大型蚤产生明显毒性效应，但是21 d慢性实验表明nC60在较低浓度下（1 mg·L-1）仍能对大型蚤产生明显毒性效应。晏晓敏等[17]发现nC60在浓度低至0.5 mg·L-1时能显著降低大型蚤14 d暴露的孵化幼蚤数，在种群水平对大型蚤产生影响。与传统的污染物相比，nC60的慢性毒性低于Ni和壬基苯酚，但是高于两种主要树脂酸：脱氢乙酸和松香酸[18-20]。

其他人工纳米材料对大型蚤的毒性先前已有报道。朱小山等[21]研究发现单壁碳纳米管（SWCNTs）和多壁碳纳米管（MWCNTs）对大型蚤活动的48 h EC50值分别为1.3 mg·L-1和8.7 mg·L-1；李轶等[22]实验表明纳米二氧化钛对大型蚤72 h LC50和EC50分别为22.7 mg·L-1和16.7 mg·L-1。毒性的大小可能与纳米材料的性质有关。

已有文献表明，nC60也会对其他水生模式生物产生急、慢性毒性。晏晓敏等[17]研究发现，nC60浓度达8 mg·L-1时尽管不影响青鳉（Oryziaslatipes）胚胎孵化率，但增加孵化幼鱼的畸形率。朱小山等[21]研究表明nC60对斜生栅藻生长的96 h的EC50值为13.1 mg·L-1。本研究对nC60的水生生物毒性数据进行了一定补充。

nC60进入水体会发生团聚[23]，很容易被大型蚤吸入肠道内并难以排出体外[10]，据此我们推测nC60对肠道粘膜的物理损伤是使大型蚤致毒的主要原因之一。

由于动物的行为是联系生态过程和生物生理机能的纽带，其对研究污染物的毒性效应具有重要意义。行为指标比死亡率对于评价污染物毒性更加敏感。对于大型蚤而言，跳跃、心跳和摄食行为是几个易于观察的行为指标，因此本文选择其二来评价nC60对大型蚤的毒性。Tao等[13]研究了nC60对大型蚤跳跃频率的影响，其研究结果表明大型蚤的跳跃频率与暴露时间呈正相关。在本研究中，实验初期的现象与Tao等研究基本一致，但是随着暴露时间的延长，大型蚤的跳跃频率逐渐降低，游动变得迟缓。对这种实验现象的出现可以作出推测：大型蚤在摄入nC60的初始阶段，由于纳米颗粒在大型蚤体内的累积使大型蚤做出应激行为，表现为猛烈地跳动以排出体内的nC60颗粒；但是随着时间延长，nC60的毒性作用显现，大型蚤逐渐出现中毒症状，活动变得迟钝。在本研究中，心跳频率的变化趋势与跳跃频率的变化趋势一致。心跳在一定程度上反映机体的能量供给情况，心跳频率的变化在一定程度上对跳跃频率的变化作出了解释。

4 结论

（1）nC60暴露下大型蚤的跳跃和心跳活动会受到抑制，浓度越高抑制越明显。

（2）nC60对大型蚤的48 h急性毒性指标EC50和LC50分别为25.3 mg·L-1和28.5 mg·L-1，72 h的EC50和LC50分别为14.9 mg·L-1和16.3 mg·L-1。

（3）在1 mg·L-1浓度下，nC60对大型蚤的繁殖产生影响，具有明显慢性毒性。

[1]Gokhale M M,Somani R R.Fullerenes：Chemistry and its application[J]. Mini-Reviews in Organic Chemistry,2015,12（4）：355-366.

[2]Says C M,Marchione A A,Reed K L,et al.Comparative pulmonary toxicity assessments of C60water suspensions in rats：Few differences in fullerene toxicityin vivoin contrast toin vivoprofiles[J].Nano Letters, 2007,7（8）：2399-2406.

[3]Dhawan A,Taurozzi J S,Pandey A K,et al.Stable colloidal dispersions of C60fullerene in water：Evidence for genotoxicity[J].Environmental Science&Technology,2006,40（23）：7394-7401.

[4]Lyon D Y,Adams L K,Falkner J C,et al.Antibacterical activity of fullerene water suspensions：Effects of preparation method and particlesize[J].Environmental Science&Technology,2006,40（14）：4360-4366.

[5]Isakovic A,Markovic Z,Todorovic-Markovic B,et al.Distinct cytotoxic mechanisms of pristine versus hydroxylated fullerene[J].Toxicological Sciences,2006,91（1）：173-183.

[6]Says C M,Gobin A M,Ausman K D,et al.Nano-C60cytotoxicity is due to lipid peroxidation[J].Biomaterials,2005,26（36）：7587-7595.

[7]Liu X J,Ni I H,Wang W X,et al.Trophic transfer of heavy metals from freshwater zooplanktonDaphnia magna to zebrafish Danio rerio[J].Water Research,2002,36（18）：4563-4569.

[8]朱小山.几种人工纳米材料的生态毒理学研究[D].天津：南开大学, 2007：94-102.

ZHU Xiao-shan.Ecotoxicological studies of several manufactured nanomaterials[D].Tianjin：Nankai University,2007：94-102.

[9]Tao X J,Fortner J D,Zhang B,et al.Effects of aqueous stable fullerene nanocrystals（nC60）onDaphnia magna：Evaluation of sublethal reproductive responses and accumulation[J].Chemosphere,2009,77（11）：1482-1487.

[10]Tervonen K,Waissi G,Petersen E J,et al.Analysis of fullerene C60and kinetic measurements for its accumulation and depuration inDaphnia magna[J].EnvironmentalToxicologyandChemistry,2010,29（5）：1072-1078.

[11]Tao X J,Yu Y X,Fortner J D,et al.Effects of aqueous stable fullerene nanocrystal onScenedesmus obliquus：Evaluation of the sublethal photosynthetic responses and inhibition mechanism[J].Chemosphere,2015, 122（53）：162-167.

[12]Britto R S,Flores J A,Mello D D,et al.Interaction of carbon nanomaterial fullerene（C60）and Microcystin-LR in gills of fishCyprinus carpio（Teleostei：Cyprinidae）under the incidence of ultraviolet radiation[J].Water,Air,and Soil Pollution,2015,226（1）：1-9.

[13]Tao X J,He Y L,Zhang B,et al.Effects of stable aqueous fullerene nanocrystal（C60）onDaphnia magna：Evaluation of hop frenquency and accumulation under different conditions[J].Journal of Environmental Sciences,2011,23（2）：322-329.

[14]赵丽红.纳米二氧化钛与环境污染物对斜生栅藻联合毒性效应研究[D].北京：清华大学,2015：18-30.

ZHAO Li-hong.Joint toxicity of nanotitanium dioxide and environmental pollutants onScenedesmus obliquus[D].Beijing：Tsinghua University,2015：18-30.

[15]Yang X Y,Edelmann R E,Oris J T.Suspended C60nanoparticles protect against short term UV and fluoranthene photo-induced toxicity, but cause long term cellular damage inDaphnia magna[J].Aquatic Toxicology,2010,100（2）：202-210.

[16]Zhu S Q,Oberdorster E,Haasch M L.Toxicity of an engineered nanoparticle（fullerene,C60）in two aquatic species,Daphniaand fathead minnow[J].Marine Environmental Research,2006,62（Suppl）：5-9.

[17]晏晓敏,查金苗,石宝友,等.纳米富勒烯聚集体与阿特拉津复合体系对水生生物的毒性[J].科学通报,2009,54（23）：3612-3618.

YAN Xiao-min,ZHA Jin-miao,SHI Bao-you,et al.Toxicity of nano fullerene aggregates and atrazine composite system to aquatic organisms[J].Chinese Science Bulletin,2009,54（23）：3612-3618.

[18]Kamaya Y,Tokita N,Suzuki K.Effects of dehydroabietic acid and abietic acid on survival,reproduction,and growth of the crustaceanaphnia magna[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2005,61（1）：83-88.

[19]Pane E F,Mcgeer J C,Wood C M.Effects of chronic waterborne nickel exposure on two successive generations ofDaphnia magna[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2004,23（4）：1051-1056.

[20]Villarroel M J,Sancho E,Ferrando M D,et al.Acute,chronic and sublethal effects of the herbicide propanil onDaphnia magna[J].Chemosphere,2003,53（8）：857-864.

[21]朱小山,朱琳,田胜艳,等.三种碳纳米材料对水生生物的毒性效应[J].中国环境科学,2008,28（3）：269-273.

ZHU Xiao-shan,ZHU Lin,TIAN Sheng-yan,et al.Toxicity of three kinds of carbon nano-materials to aquatic organisms[J].China Environment Science,2008,28（3）：269-273.

[22]李轶,殷亚远,王超,等.纳米二氧化钛和铜对大型溞的联合毒性[J].河海大学学报（自然科学版）,2016（2）：95-100.

LI Yi,YIN Ya-yuan,WANG Chao,et al.Joint toxicity of nanotitanium dioxide and copper onDaphnia magna[J].Journal of Hohai University（Natural Science Edition）,2016（2）：95-100.

[23]Hu X L,Li J,Shen M H,et al.Fullerene-associated phenanthrene contributes to bioaccumulation but is not toxic to fish[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2015,34（5）：1023-1030.

Toxicity assessments of fullerene to Daphnia magna：Acute toxicity and chronic toxicity

HUANG Bo-ming1,2,LÜ Xiao-hui2,3,WANG Qiu-li4,ZHU Xiao-shan2*,ZHOU Jin2,CAI Zhong-hua2
（1.School of Environment,Tsinghua University,Beijing 100084,China;2.Graduate School at Shenzhen,Tsinghua University,Shenzhen 518000,China;3.Shenzhen Graduate School,Harbin Institute of Technology,Shenzhen 518000,China;4.Liaoning Environmental Monitoring &Experiment Center,Shenyang 110161,China）

The toxicity of fullerene（nC60）on aquatic organisms has received increasing concerns due to its proliferated applications and the increasing occurrence potential in water environments.The present study evaluated the acute and chronic toxicity of nC60in a model animal, zooplanktonDaphnia magna,using immobilization and mortality as the observation endpoints.The 48 h and 72 h EC50values of nC60were 25.3 mg·L-1and 14.9 mg·L-1,respectively,and the LC50values were 28.5 mg·L-1（48 h）and 16.3 mg·L-1（72 h）,respectively.Moreover, nC60exposure led to increasing hop and heartbeat frequencies ofD.magnain the initial experiment stage,while the hop and heartbeat frequencies decreased with longer exposure time.During chronic exposure,the reproduction ofD.magnawas significantly repressed at the concentration of 1 mg·L-1.A significantly decrease of the total yield and the average yield ofD.magnawas observed after 21-d exposure. These results suggested that the leakage of nC60,could pose risks to the aquatic animals such asD.magna,which indicated that the aquatic toxicity of nC60should not be ignored.

Daphnia magna;nC60;acute toxicity;chronic toxicity

X171.5

A

1672-2043（2017）04-0620-05

10.11654/jaes.2016-1570

2016－12－07

黄勃铭（1990—），男，河北廊坊人，硕士研究生，从事纳米材料生态毒理学研究。E-mail：dmxjhbm@163.com

*通信作者：朱小山E-mail：zhu.xiaoshan@sz.tsinghua.edu.cn

国家自然科学基金项目（41373089,41573094）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（41373089，41573094）

黄勃铭，吕小慧，王秋丽，等.富勒烯对大型蚤的急性毒性和慢性毒性效应[J].农业环境科学学报,2017,36（4）：620-624.

HUANG Bo-ming,LÜ Xiao-hui,WANG Qiu-li,et al.Toxicity assessments of fullerene to Daphnia magna：Acute toxicity and chronic toxicity[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（4）:620-624.