芪参二莲汤对肝纤维化大鼠血清基质金属蛋白酶—1及其抑制剂—1水平的影响

袁星星 郭蕾 王炳予 杨磊 刘长发 张雅丽

摘要：目的 觀察芪参二莲汤对硫代乙酰胺（TAA）诱导大鼠肝纤维化的逆转作用和血清基质金属蛋白酶-1（MMP-1）及其抑制剂-1（TIMP-1）水平的影响，探讨其作用机制。方法 采用TAA灌胃法制造肝纤维化模型，120只SPF级SD雄性大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组和芪参二莲汤低、中、高剂量组，各给药组给予相应药物灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续5周。采用HE和Masson染色观察肝脏组织病理形态及损伤程度，采用生化分析、放免法、ELISA检测血清肝功能、肝纤维化四项及MMP-1、TIMP-1水平。结果 与模型组比较，芪参二莲汤各剂量组均能显著降低大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、γ-谷氨酰转酞酶及透明质酸、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原水平，MMP-1和MMP-1/TIMP-1比值显著升高，TIMP-1水平显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01），并且存在一定的量效关系，以芪参二莲汤高剂量组疗效最佳。结论 芪参二莲汤可明显改善肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化指标，调控MMP-1与TIMP-1水平，阻止肝纤维化病情的进展。

关键词：芪参二莲汤；肝纤维化；细胞外基质；基质金属蛋白酶-1；金属蛋白酶抑制剂-1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.013

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）05-0052-05

Effects of Qishen Erlian Decoction on Serum MMP-1 and TIMP-1 in Liver Fibrosis Model Rats YUAN Xing-xing1， GUO Lei2， WANG Bing-yu1， YANG Lei1， LIU Chang-fa1， ZHANG Ya-li1 （1. Nangang Branch of Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin 150001， China； 2. Qiqihar Hospital of Traditional Chinese Medicine， Qiqihar 161000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Qishen Erlian Decoction on serum MMP-1 and TIMP-1 levels in thioacetamide （TAA） induced liver fibrosis rats； To discuss its mechanism of action. Methods Liver fibrosis model was created by the TAA gavage method. 120 SD male rats were randomly assigned to control group， model group， colchicine group， Qishen Erlian Decoction low-， medium- and high-dose group （20 in each group）. Each medication group was given relevant medicine for gavage. Control group and model group were given the same amount of normal saline for gavage， once a day for 5 weeks. HE staining and Masson trichrome staining were used to observe the pathological changes in liver tissue and liver tissue damage. Biochemistry， radioimmunoassay， and ELISA were used to detect the serum liver function， hepatic fibrosis index， MMP-1 and TIMP-1 levels. Results Compared with the model group， serum ALT， AST， TBIL， γ-GGT， HA， LN， Ⅳ-C and PCⅢ levels， MMP-1 and the ratio of MMP-1/TIMP-1 increased significantly and level of TIMP-1 decreased significantly in Qishen Erlian Decoction groups， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. And there is a certain dose-effect relationship， with Qishen Erlian Decoction high-dose group the best effect. Conclusion Qishen Erlian Decoction can improve the liver function and liver fibrosis indexes， regulate the level of MMP-1 and TIMP-1， and prevent the progression of liver fibrosis.

Key words： Qishen Erlian Decoction； liver fibrosis； extracellular matrix； MMP-1； TIMP-1； rats

肝纤维化是在体内有害因素的持续刺激下，肝脏内弥漫性细胞外基质（ECM）的合成和降解失去平衡的一种病理变化，属于肝损伤后组织修复过程中的一种代偿反应，也是肝硬化发展的必经阶段。而基質金属蛋白酶类（MMPs）和金属蛋白酶抑制剂（TIMP）两者的平衡在ECM的合成与降解中发挥重要作用。有研究发现，通过对MMPs/TIMPs平衡的干预，可抑制ECM合成，促进其降解，故其已成为逆转肝纤维化的重要方法[1]。芪参二莲汤为黑龙江省中医药科学院著名肝病专家张雅丽教授治疗肝纤维化经验方，具有益气扶正、活血解毒、化痰通络的功效。我们前期研究发现，芪参二莲汤可通过减轻炎性细胞因子对肝细胞的直接损伤，抑制炎症向肝细胞浸润，具有明显的抗炎、保肝及调节免疫的功能，对肝纤维化具有一定拮抗作用[2-4]。为了进一步探究其对肝纤维的逆转作用，本实验采用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）灌胃法制备肝纤维化模型，通过检测大鼠肝功能、肝纤维化指标，监测ECM代谢因子MMP-1、TIMP-1水平及其比值变化，探讨芪参二莲汤对大鼠肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠120只，雄性，2月龄，体质量（200±20）g，黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号[黑动字第]P00102005。饲养于黑龙江省中医药科学院实验动物中心，室温18～25 ℃、相对湿度50%～60%、人工12 h昼夜循环照明环境，分笼饲养，自由摄食饮水。

1.2 药物

芪参二莲汤（黄芪15 g，茵陈蒿10 g，虎杖10 g，西洋参10 g，半边莲10 g，半枝莲10 g，猫爪草10 g，石见穿10 g，女贞子15 g，墨旱莲15 g，五味子15 g，甘草15 g），上述饮片购自黑龙江省中医药科学院中药房，本院煎药室制备并浓缩；秋水仙碱片，昆明制药集团股份有限公司，0.5 mg/片，批号201410213，用前研细粉过100目筛，用蒸馏水配成混悬液。TAA，上海麦克林生化科技有限公司，批号MFCD00008070。

1.3 主要试剂与仪器

丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号20142301、20141161；总胆红素（TBIL）试剂盒，上海荣盛生物药业有限公司，批号20140806107；γ-谷氨酰转酞酶（γ-GGT）检测试剂盒，桂林优利特医疗电子集团公司，批号25120784；透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20100514；大鼠MMP-1、TIMP-1 ELISA试剂盒，美国RapidBio Lab. Calabasas，批号分别为13070822、13070866；Masson三色染色试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司，批号20140514。石蜡切片机（RM2145，德国Leica），石蜡包埋机（EG1140，德国Leica），荧光显微镜（DM1L，德国Leica），酶标仪（Benchmark plus型，美国Bio RAD），全自动生化分析仪（日立7600-020，日本HITACHI），CO2培养温箱（3949型，美国Forma Scientific）。

1.4 分组、造模与给药

大鼠适应性饲养1周后，按体质量随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组和芪参二莲汤低、中、高剂量组，每组20只。除正常组大鼠常规饲养外，余组大鼠采用TAA灌胃法制造肝纤维化模型[5-8]，隔日1次，连续7周。药物组按照秋水仙碱（0.105 g/kg）和芪参二莲汤低（5 g/kg）、中（10 g/kg）、高（15 g/kg）剂量灌胃给药，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积均为8 mL/kg，每日1次，连续5周。

1.5 标本制备

实验结束后，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（1 mL/100 g）麻醉，静脉取血，静置，5000 r/min离心7 min，收集血清，-80 ℃冰箱保存备用，于肝左叶距边缘0.5 cm处取2块1 cm×1 cm×0.5 cm大小组织块。

1.6 指标检测

1.6.1 肝组织病理形态 HE染色将肝组织切片经二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、蒸馏水、苏木素染液、盐酸乙醇溶液、清水、清水、氨水溶液、伊红染液、蒸馏水、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ后入通风橱封片。Masson染色切片将肝组织脱蜡、苏木素染、流水稍洗、1%盐酸乙醇分化、流水冲洗、丽春红酸性品红液染、蒸馏水、1%磷钼酸水溶液、2.5%亮绿液染色、1%冰醋酸、95%乙醇、100%二甲苯。镜下观察肝脏组织病理形态及肝损伤程度。

1.6.2 肝功能检测 采用全自动生化分析仪，对血清ALT、AST、TBIL、γ-GGT进行检测。

1.6.3 肝纤维化指标检测 放射免疫分析法检测血清HA、LN、PCIII、Ⅳ-C含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6.4 血清基质金属蛋白酶-1及其抑制剂测定 采用ELISA试剂盒及酶标仪测定大鼠血清MMP-1、TIMP-1含量，取出96孔板，设置标准品孔、空白孔、模型孔、秋水仙碱孔和芪参二莲汤低、中、高剂量孔，加入标准品50 μL预计的标准品浓度梯度；按照顺序在待测样本孔中加入待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL，重复洗板3次后加酶标工作液，然后按顺序每孔先加入显色剂A液50 μL，再加入显色剂B液50 μL，于37 ℃恒温箱中避光显色15 min。用酶标仪检测。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析，组间两两比较用LSD法检验，等级资料多组独立样本用秩和检验。P<0.05表示差異有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

正常组大鼠与芪参二莲汤高剂量组营养状况良好，饮食和体态正常，反应灵敏，眼光有神，皮毛密集伴有光泽，体质量自然增加。余各组大鼠一般情况差，饮食少，皮毛发黄黯淡无光，伴轻度脱毛，潮湿成缕，体形消瘦，反应迟钝，烦躁易激惹。实验过程中大鼠部分死亡，原因可能为灌胃损伤或对药物耐受性差异等，模型组大鼠死亡3只，秋水仙碱组和芪参二莲汤低、中剂量组各死亡2只。

2.2 芪参二莲汤对大鼠肝脏组织病理形态的影响

HE染色结果显示，正常组大鼠肝组织的肝小叶完整，肝细胞排列整齐，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无变性坏死，未见纤维组织增生；模型组肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性，部分坏死，伴有炎性细胞浸润，纤维组织大量增生；各给药组肝脏损伤程度均较模型组明显减轻，肝小叶结构破坏减轻，肝脏胶原纤维增生减轻，肝细胞水肿好转，变性情况明显改善，炎细胞浸润减少，其中以芪参二莲汤高剂量组肝脏结构改善最为明显。结果见图1。

Masson染色结果显示，正常组大鼠肝细胞索排列整齐，在汇管区与间质的小血管壁上少量蓝色的胶原纤维分布；模型组胶原纤维明显增多，多分布在汇管区和血管周围，形成纤维间隔，破坏肝小叶结构；各给药组均较模型组减轻，胶原纤维组织增生均有不同程度的减少，纤维化程度有明显好转，部分较细的蓝色纤维走行于血管周围，其中以芪参二莲汤高剂量组肝脏结构改善最为明显。结果见图2。

2.3 芪参二莲汤对模型大鼠血清肝功能的影响

与正常组比较，模型组ALT、AST、γ-GGT、TBIL水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清ALT、AST、TBIL、γ-GGT水平显著降低（P<0.05，P<0.01），其中以芪参二莲汤高剂量组疗效最佳（P<0.01）。结果见表1。

2.4 芪参二莲汤对模型大鼠血清肝纤维指标的影响

与正常组比较，模型组HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清HA、LN、IV-C、PCⅢ水平显著降低（P<0.05，P<0.01），其中以芪参二莲汤高剂量组疗效最佳（P<0.01）。结果见表2。

2.5 芪参二莲汤对模型大鼠血清基质金属蛋白酶-1及其抑制剂-1水平的影响

与正常组比较，模型组MMP-1、MMP-1/TIMP-1比值显著降低（P<0.01），TIMP-1显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组MMP-1和MMP-1/ TIMP-1比值显著升高，TIMP-1水平显著降低（P<0.05，P<0.01），其中以芪参二莲汤高剂量组疗效最佳（P<0.01）。结果见表3。

3 讨论

中医学认为，肝纤维化属“积聚”“癥瘕”范畴，其病机为络气不足，气虚血瘀，外感湿热久羁，凝聚成痰，发为本病证。故肝纤维化多为本虚标实，虚实夹杂。芪参二莲汤用药以益气扶正为主，兼以解毒化痰逐瘀。本方重用黄芪，其为补药之长，气充帅血，祛瘀散结；西洋参、五味子、墨旱莲、女贞子滋补肝肾、活血通络，养血以柔肝体；半边莲、半枝莲清利湿热；石见穿、猫爪草化痰散结，解毒化瘀；茵陈蒿、虎杖、甘草散瘀退黄，清血分肝络之毒。综观全方，扶正祛邪，扶正不助邪，逐瘀与化痰并行，共奏益气扶正、活血解毒、化痰通络之功。

本课题结合肝脏组织病理学、肝功能、肝纤维化四项检测，对芪参二莲汤治疗肝纤维化的疗效进行研究，通过HE与Masson染色联合对照观察。结果显示，正常组大鼠肝脏组织均无明显异常改变；模型组肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性，部分肝细胞坏死，伴有中性粒细胞及淋巴细胞浸润，纤维组织大量增生，个别大鼠可见假小叶形成；各给药组肝脏损伤程度均较模型组减轻，而且芪参二莲汤能够明显改善肝纤维化大鼠ALT、AST、TBIL、γ-GGT及HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ水平，其中以芪参二莲汤高剂量组疗效最佳。

肝脏的ECM过度沉积形成肝纤维化，而ECM在肝内过度沉积不仅仅是由于ECM合成增多，更大程度上是由于ECM降解减少[9]。然而，机体主要是通过MMPs与TIMPs的动态平衡来调节ECM的生成和降解，MMP-1能降解纤维化肝组织中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原，而ECM主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积[10]。TIMP-1可抑制MMP-1的活性，导致ECM降解减少。当MMP-1和TIMP-1比例失调时，导致胶原酶活性减弱，使肝组织内胶原代谢紊乱，Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少而沉积，造成肝纤维化的进一步恶化[11]。史玉岭[12]使用ROC曲线评估TIMP-1诊断肝纤维化的敏感度、特异性，结果显示其明显高于肝纤维化标志物HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN，提示血清TIMP-1诊断肝纤维化有较高的敏感度和特异性，其水平反映肝纤维化程度。本研究结果显示，TAA诱导肝纤维化模型大鼠较正常组大鼠血清MMP-1水平明显降低，TIMP-1较正常组明显升高，MMP-1/TIMP-1较正常组明显降低，与近年来肝纤维化形成过程中有关MMPs与TIMPs表达的相关研究结果一致[13]。而芪参二莲汤能显著提高MMP-1水平，降低TIMP-1水平，从而调整MMP-1/TIMP-1的平衡，达到逆转肝纤维化的目的。

综上，芪参二莲汤能明显改善肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化指标，促进MMP-1/TIMP-1平衡，从而达到防治肝纤维化的作用，且存在一定的量效关系。

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