可降解PBSLA嵌段共聚物对蚯蚓酶活的影响

吴昊

摘 要：采用自然土壤法，研究了可生物降解PBSLA嵌段共聚物对蚯蚓超氧化歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）两种抗氧化酶活性的影响。结果表明：整个实验过程中，SOD和POD均在一定的时期内受到了刺激作用，但这种刺激都比较小。低分子量共聚物的影响出现较早，高分子量共聚物的对蚯蚓的毒性影响经过一定时间才表现出来，即滞后现象。值得注意的是，实验末期，实验组中蚯蚓酶活的变化与空白组基本处于相同水平。总之，实验过程中蚯蚓未出现明显的死亡现象，该聚合物对蚯蚓是安全的。

关键词：聚丁二酸丁二醇酯-聚乳酸；蚯蚓；超氧化歧化酶过氧化物酶；过氧化物酶

研究发现由于聚酯中大量酯键的存在，所以很多聚酯能够被微生物识别而发生微生物降解。其中聚丁二酸丁二醇酯（PBS）是一种具有广泛应用前景的可生物降解聚酯。所以研究该聚合物对生态系统的毒性是非常有价值的。

研究物质对土壤环境毒性的一种常用的方法是利用蚯蚓进行试验。经过研究学者的努力，通过判断蚯蚓体内酶活的变化来判断环境的污染程度已成为也一种标准。蚯蚓体内的抗氧化物酶包括超氧化物岐化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）。其中SOD的作用是能够将机体内的O2-转变为H2O2，而CAT和POD可以将H2O2分解为氧气和水。

关于其它可降解材料对蚯蚓的影响已有研究，然而关于PBSLA嵌段共聚物对蚯蚓体内抗氧化物酶活的影响还没有报道。因此，文章研究了PBSLA嵌段共聚物对蚯蚓体内两种抗氧化物酶活的影响。

1 试验材料与测试方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品

所提供的试验样品为实验室所合成PBSLA嵌段共聚物，分子量分别为5000、20000和30000。

1.1.2 试验试剂和测试仪器

考马斯亮蓝G-250；牛血清蛋白；DNS；葡萄糖。

组织粉碎机；人工培养箱。冷冻离心机。UV-2006A型可见紫外分光光度计。凝胶液相色谱仪。

1.1.3 供试蚯蚓和土壤

蚯蚓购于天龙蚯蚓养殖公司，实验前预处理：选择大小均匀（0.3-0.5g），生殖环比较明显的健康成蚓。

自然突然实验法：取自咸阳郊区表土（0～20cm厚的地表土），烘干，研磨，过筛（10目，2mm），试验土壤为 土，全氮0.92g·kg-1，全磷0.82g·kg-1，土壤有机质10.76g·kg-1（有机碳6.48g·kg-1），速效钾289.0mg·kg-1，pH=8.4，碱解氮58.87mg·kg-1，速效磷14.5mg·kg-1。

1.2 试验步骤

根据OECD guideline No 207标准方法，进行毒性试验研究。

1.2.1 蚯蚓预培养

将直径为15cm的三层滤纸铺在1l的烧杯中，滴加5ml去离子水，充分润湿滤纸，并使得滤纸和烧杯底部无空隙存在。将试验所需蚯蚓放在湿润的滤纸上。（注：蚯蚓数量不宜太多，可分為多个烧杯培养。）然后用滤纸将烧杯口封住，并用竹签对滤纸进行扎孔，最后将烧杯放入人工培养箱中，放置一昼夜。培养箱预设条件：20.5℃， 80%～85%的湿度。

毒性试验：分别将试验样品（三种分子量的PBSLA共聚物）用粉碎机进行粉碎10分钟，称取定量的粉末样品（0.1%wt，0.5%wt，2.5%wt）与0.3g的试验土壤加到试验容器中进行混合，搅拌均匀后，用喷雾器定量喷洒6ml自来水，控制容器内的湿度在35%左右。取大小均匀的10条蚯蚓于试验容器中进行培养，用定性滤纸封口后，在用竹签进行均匀扎孔。最后试验容器在人工培养箱中进行培养。培养条件：20.5℃，80%～85%的湿度，每隔12个小时进行光照培养。每隔一定时间进行取样，然后进行粉碎，提取，测试蚯蚓体内酶活。试验周期为30天，且每组试验均设置3组平行样进行对照试验。

1.2.2 酶的提取

酶的提取方法：将取出来的每组蚯蚓用自来水进行冲洗后，用滤纸擦干，放入组织粉碎机中，按照一定比例（1mg/ml）加入Tris-HCl缓冲溶液，对蚯蚓进行粉碎，转速为10000rpm的转速，将得到的匀浆液用冷冻离心机进行分离（冷冻离心条件：4℃，15000rpm，15分钟）。取上清液0.5ml，加入0.05mol/l Tris-HCl缓冲液（pH为7.8）1ml，定容至1.5ml。

1.2.3 酶活的测定

酶活性测定：SOD活性的测定参考自俊青等（1998）的方法。POD活性的测定参考吕淑霞等（2003）的方法。

1.2.4 数据统计

利用软件SPSS17.0将所得到的每组蚯蚓酶活数据，进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 PBSLA对SOD酶活的影响

从图1可以看出，分子量为5.0×103的PBSLA处理组中，在第7d和第14d时（P<0.05），不同含量的处理组中均出现SOD增加的现象。这是由于刚开始由于蚯蚓周围环境的变化，使得蚯蚓体内的一些平衡被打乱，O2-增多，因此为了更好的适应环境，蚯蚓通过自身的调节，使得体内SOD酶分泌增加，活性也增加。到第28d和42d时（P<0.01），蚯蚓已能够逐渐的适应外界的环境，因此又恢复到与空白一样的水平。图2中可以观察到，Mn为2.0×104的PBSLA实验中（P<0.05），第7d和第14d的变化规律与图一中相似，只是变化趋势有所减小。这是由于，分子量增加，聚合物中的小分子物质有所减少，因此导致了能够直接对蚯蚓产生影响的小分子物质减少。从图3中可以明显的看出，聚合物分子量达到3.0×104时，不同的处理组中，SOD并没有发生较明显的变化。这是由于蚯蚓已经适应了周围的环境，并且聚合物在降解过程产生的小分子不足以对蚯蚓的SOD产生较大的影响。

2.2 PBSLA对POD酶活的影响

从图4中可以看出，实验组中POD的活性均表现出一定的规律性：POD酶活随聚合物含量的增加而增加，当聚合物的含量为0.5%wt时，酶活变化的速率最大，经过一段时间后酶活又开始缓慢增加（P<0.05）。这是由于刚开始蚯蚓周围环境的变化，使得蚯蚓机体内POD所分解的物质增加，因此，为了更好的适应环境，POD活性也开始增加。从图5中可以观察到第7d和第14d时，实验组中的POD活性没有发生明显的变化，而从第32d开始（P<0.01），POD活性逐渐的增加，与图1中相比，出现了明显的滞后现象。这说明了聚合物在降解时是一个比较缓慢的过程，由于刚开始聚合物中的小分子比较少，且没有发生降解，因此不足以对蚯蚓产生影响，而随着时间的增长，聚合物逐渐的发生降解，因此这种作用到后期才表现出来。图6更加说明了聚合物含量为2.5%时，从第32d开始，POD才出现明显的增加趋势（P<0.05）。

3 结束语

（1）蚯蚓体内不同种酶对聚合物所做出的反应不同，敏感程度表现为SOD>POD。（2）低分子量聚合物对蚯蚓的影响较高分子量的要大些，但是都是短暂的，最终的结果均表现为与空白组相同的水平。（3）在整个实验过程中，蚯蚓并没有出现明显的死亡、环节脱落、尾溶等现象，所以初步判定PBSLA共聚物对蚯蚓是安全的。