基于ITS条形码序列早期筛选枸杞种内杂交种

石志刚++马婷慧++万如++李彦龙++王亚军

摘要：利用核糖体内转录间隔区（ITS）条形码序列，对枸杞杂交育种种内杂交种进行早期筛选研究。采用改进的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取枸杞叶片DNA，利用合成的特异引物对其DNA中的nrDNA ITS区进行扩增、克隆，对目的片段进行测序分析。结果表明：以宁夏枸杞种内的品种宁杞1号、宁杞2号、白花枸杞作为父母本，选配杂交组合，基于ITS条形码序列对其种内杂交育种产生的杂交后代进行聚类分析，分析杂交后代与父母本的亲缘关系与差异，对其杂交后代进行早期筛选。由结果可知，基于ITS条形码序列可以作为早期筛选杂交育种后代的方法之一，对建立分子标记辅助育种技术、缩短育种周期具有重要意义。

关键词：枸杞属；ITS序列；DNA测序；筛选；杂交育种

中图分类号： S337；S567.1+90.351文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）06-0138-02

枸杞是我国重要的“药食同源”功能型特色植物资源，经济、生态、社会效益显著[1]。宁夏是枸杞的原产地和主产区，截至2015年年底，宁夏枸杞种植规模达到5.71万hm2，占全国种植总面积的42.5%；枸杞干果产量13万t，占全国总产量的48%；年出口量6 500 t，出口額7 000万美元，占全国出口量的65%，出口额的58%；枸杞生产总值突破50亿元。宁夏地区自20世纪60年代就已经开展枸杞新品种育种工作，目前宁夏农林科学院自主选育出宁杞1号、宁杞2号、宁杞3号、宁杞5号、宁杞6号、宁杞7号、宁农杞9号等10余个新品种，国内科技工作者也选育出柴杞1号、蒙杞1号、精杞1号等新品种。但是枸杞育种在整体上与其他作物育种相比，还存在许多不足和缺陷，主要体现在以下几点：（1）实用生产型品种相对偏少，在生产中大面积推广应用的品种仅有宁杞1号、宁杞4号、宁杞5号和宁杞7号等4个新品种，并且其用途相对单一，不能很好地适应枸杞产业多元化发展的方向；（2）育种手段相对单一，育种周期长、速度慢。近年来，分子标记技术发展很快，对于深入了解植物基因的多态性、有针对性地选择亲本、对杂种后代进行早期鉴定等方面，都能提供更为有效的判断依据，从而提高育种效率[2]。通过群体选优、杂交育种、细胞融合等技术，建立多样化育种理论体系和技术体系，培育多用途的枸杞新品种，对于提升枸杞产业的研究水平和枸杞产业可持续发展意义重大。本研究以枸杞杂交育种亲本和杂交品系为试验材料，通过对其种内杂交育种产生的杂交后代进行基于核糖体内转录间隔区（ITS）条形码序列的聚类分析，分析杂交后代与父母本的亲缘关系与差异，以期对其杂交后代进行早期筛选。

1材料与方法

1.1试验材料

以宁夏枸杞种内的品种宁杞1号、宁杞2号、白花枸杞作为父母本，以通过种内杂交育种产生的杂交后代05-04-17-b、05-04-31-b、05-06-27-b、05-38-36、05-31-01、05-32-31作为试验材料，材料名称、来源等见表1。

1.2试验方法

枸杞叶片DNA提取参照文献[3]的方法进行，采用改进的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法。PCR扩增引物设计、扩增程序、反应体系及目的片段的克隆参照笔者所在研究组前期的报道[4]。

1.3枸杞杂交育种父母本和杂交后代的亲缘关系分析

采用MEGA 4.0分析软件对ITS序列进行聚类分析。

2结果与分析

2.1ITS区序列长度和变异信息

宁夏枸杞不同品种间杂交种中，整个ITS序列长度变异范围为559～631 bp，平均为595 bp；整个ITS1序列长度变异范围为198～252 bp，平均为224 bp；整个5.8SnrDNA序列长度变异范围都为154 bp；整个ITS2序列长度变异范围为 207～225 bp，平均为217 bp。ITS区、分区长度及G+C含量变异见表2。

宁夏枸杞种内不同杂交种植物ITS序列特征如表3所示。整个ITS区排序后的总长度为631 bp，其中ITS1、5.8S、ITS2排序后的长度分别为252、154、225 bp。将gap（空位）作missing（缺失）处理时，由于5.8SDNA序列过于保守，不适合用作系统发育分析，因而在本研究中利用ITS1、ITS2区序列进行统计发育分析。整个转录间隔区（ITS1+ITS2）对位排列后总长度为477 bp，共有173个变异位点，变异位点数分别为114、59个，占36.3%；保守位点数304个，占63.7%；有10个信息位点，占2.1%，69个转换位点，15个颠换位点，其中ITS1区的信息位点所占比例高于ITS2区，而ITS1区的转换/颠换值高于ITS2区（表3）。

2.2亲缘关系分析

对ITS区碱基序列进行聚类分析，从图1中可以看出亲缘关系与差异。

3讨论

05-06-27-b、05-4-31-b、05-4-17-b具有相同的父母本，是宁杞1号×宁杞2号，基于ITS序列分析可知，05-4-17-b父本聚在一起，而其他2个具有父母本的序列特征，从ITS序列可以初步判断3个杂交种为真杂种。

05-31-01、05-32-31具有相同的父母本，是宁杞1号×白花，基于ITS序列分析可知，05-31-01与母本ITS序列基本一致，初步可以判定它不含父本的基因，是否为杂交后代有待进一步确定；而05-32-31同时具有父母本的序列特征，初步判定其是真杂交后代。

05-38-36是宁杞2号×宁杞1号，基于ITS序列分析，杂种与母本具有完全一致的序列特征，初步可以判定它不含父本的基因，是否为杂交后代有待进一步确定。

枸杞是多年生灌木，成龄期在4年以上，杂交群体的保存目前多采用活体方法，占用大量的土地资源和人力，随着杂交育种工作的开展，杂交群体的保存和早期鉴定对于提高育种、缩短育种周期尤为重要，亟需通过杂交后代的早期鉴定来克服和缓解庞大的杂交群体规模所带来的困难和压力。基于ITS序列差异，从聚类图可以初步判断父母本与杂交后代之间亲缘关系的远近，而且结合它们在植物学性状、细胞学性状、同工酶性状等方面的差异，可以作为枸杞早期筛选杂交后代的依据之一。

参考文献：

[1]石志刚，郭文林，门惠芹. 枸杞不同种质的nrDNA ITS序列分析研究[M]. 北京：中国林业出版社，2012：1-5.

[2]张汉明，许铁蜂，秦路平，等. 中药鉴别研究的发展和现代鉴别技术介绍[J]. 中成药，2000，22（1）：101-110.

[3]Cheng K T，Chang H C，Huang H，et al. RAPD analysis of Lycium bararum medicine in Taiwan market[J]. Bot Bull Acad Sin，2000，41（1）：11-14.

[4]Shi Z G，An W，Fan Y F，et al. Preliminary studies on identification of Lycium Linn. germplasm resources by nrDNA ITS sequencing[J]. Agricultural Science and Technology，2008，36（16）：6687-6689.吴玉香，王汉琪，沈少炎，等. 不同施肥方案对太子参活性成分的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45（6）：140-143.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.036