植物叶制片技术的改进探讨

2017-05-10唐立红王博华孙宝莹桂晓慧

赤峰学院学报·自然科学版 2017年8期

关键词：蜡块二甲苯石蜡

唐立红，柴圆，王博华，孙宝莹，桂晓慧

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰 024000）

植物叶制片技术的改进探讨

唐立红，柴圆，王博华，孙宝莹，桂晓慧

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰 024000）

本研究基于传统石蜡制片方法，以多种处于幼嫩、柔软生长状态的植物叶片为试材，针对固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、展片及烤片等制片环节，从试剂的处理浓度、处理时间、处理温度等方面进行改良，探索出适合幼嫩、柔软植物叶的制片方法.

植物叶片；石蜡切片；改进；幼嫩；柔软

石蜡制片是观察植物组织结构常用的技术之一，在研究植物形态建成、植物杂交育种、特殊植物的培育和鉴别等方面有着重要的应用[1].该技术运用石蜡与植物组织能够很好地结合这一基本原理，经过标本采集、固定、脱水（Ⅰ）、透明（Ⅰ）、浸蜡、包埋、切片、展片、烤片、脱蜡、复水、染色、脱水（Ⅱ）、透明（Ⅱ）和封片等一系列特殊处理步骤制作而成[2].在植物显微观察过程中，优良切片应具备组织结构完整、薄厚适当、组织面平整、染色清晰和反差强度大等特点.由于试材组织学和发育特征不同，其制片效果差异较大.幼嫩、柔软的植物材料，运用传统石蜡切片技术流程进行制片，常出现组织面破坏、结构不完整、染色不良等问题.近年来有学者对其制作方法进行改进研究，但研究探索都只针对一种植物进行，实验结论具有局限性.本课题以多种处于幼嫩、柔软生长状态的植物叶片为试材，通过大量试验，对常规石蜡切片技术的一系列环节进行改良[3]，旨在探索出适合幼嫩、柔软植物材料的石蜡切片方法，为植物形态解剖学研究提供一定的技术支持.

1 材料与方法

1.1 试验仪器

CS101-A型电热鼓风干燥箱（重庆试验设备厂）、YD-6D生物组织包埋机（金华市益迪医疗设备有限公司）、HM325石蜡切片机（德国MICROM）、YD-A生物组织摊片机（金华市益迪医疗设备有限公司）、YD-B生物组织烤片机（金华市益迪医疗设备有限公司）、CX41生物显微镜（日本OLYMPUS）.

1.2 试验材料

试验材料均采自赤峰学院校园或实验室内.于2015年4月至2015年6月期间，分别选取暴马丁香（Syring reticulata）、山杏（Prunus armeniaca）、蒙古栎（Quercus mogolica）、文冠(Xanthoceras sorbifolium)、紫丁香（Syringa oblata）、花红（Malus asiatica）、五叶地锦 (Parthenocissus quinquefolia)、龙爪槐 (Sophora japonica)、烟草 (Nicotiana tabacum)、高粱(Sorghum bicolor)幼嫩、柔软且生长状态良好的叶,在叶片1/2处切取1.2cm×0.5cm带中脉的部分，放入FAA固定液中.

1.3 试验方法

在传统石蜡切片制作方法的基础上，对固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、展片及烤片等制片环节[4],从试剂的处理浓度、处理时间、处理温度等方面进行改良试验，筛选出适合幼嫩、柔软植物叶片的石蜡制片方法.

1.3.1 固定固定是取材后的第一个环节，主要目的是通过化学药品的作用保存试验材料组织、细胞的形态结构，防止其变形、自溶和腐败.植物制片常用的固定剂为FAA液，是用60%（或70%酒精）、冰醋酸、福尔马林按18:1:1比例混匀制成.本试验降低了酒精溶液浓度，将60%酒精溶液替换为50%酒精溶液.试验材料切取后立即将其投入配置好的FAA固定液中固定.

1.3.2 脱水与透明常规石蜡制片采用乙醇梯度脱水、二甲苯透明[5]，具体方式为50%乙醇（ALC）（1h）→70%ALC(1h)→85%ALC(1.5h)→95%ALC(2h)→100%ALC(2h)；1/2无水乙醇1/2二甲苯（2h）→二甲苯（2h）.本试验增加了脱水梯度并缩短了每级脱水、透明时间.具体操作为将试验材料从FAA固定液中取出分别装到包埋盒中，经各级乙醇、二甲苯溶液进行脱水、透明处理.乙醇浓度、脱水和透明时间依次为30% ALC(30min)→50%ALC(20min)→70%ALC(20min)→85%ALC (20min)→95%ALC(20min)→100%ALC（15min）→100%ALC（15min）；1/2无水乙醇 1/2二甲苯（20min）→二甲苯（20min）.

1.3.3 浸蜡与包埋本试验将透明后的材料取出后直接放入1:1的无水乙醇：蜡屑的饱和溶液中，并置于38℃恒温箱中12h后移入62℃熔融的纯蜡（熔点为56℃～58℃）中，每隔4h更换一次纯蜡（共换两次）.将渗透好石蜡的植物材料直接立于包埋盒内的熔蜡中进行石蜡包埋.包埋时蜡台、蜡嘴、蜡锅温度调整为60℃、68℃、62℃.改变了传统的材料与蜡屑同时放入的方式，纯蜡的透浸由3次改为2次，处理温度在原操作基础上也相应的做了下调.

1.3.4 展片及烤片展片在44℃水浴锅中进行，将无破损的材料切片捞至载玻片中央，并置于37℃烤片机上进行干燥固定，24小时后进行染色处理.展片的温度由原来的45℃调整为44℃；烤片温度也由38℃改变为37℃.

明确各环节对不同试验材料最佳的处理方式，对各环节的处理方式进行优化组合试验.在传统石蜡制片方法基础上进行制片，观察切片效果，筛选最佳方案.

2 结果与分析

幼嫩、柔软的植物叶片，运用改良方法制得的永久切片，其形态结构完整、细胞界限清晰、染色反差大、切片整洁，具有较好地观察效果（图1）.

柔软幼嫩的植物组织，其含水量相对较大、质地韧性低、结构抗性差.低浓度的酒精固定液可缓和材料制片时的破碎反应.30%的酒精梯度脱水及脱水透明时间的缩短，减缓了脱水剂、透明剂引起的组织收缩反应，处理后的材料其硬度下降，制片不易破碎.

浸蜡时材料直接放入融好的无水乙醇、蜡屑的饱和溶液中，可使材料与石蜡更好的有机融浸，切片时材料韧性增加，不易破碎.纯蜡透浸数减少及浸蜡、包埋时温度的下调，缓解了高温对幼嫩材料的破坏作用，从而降低了制片的破碎度.

3 结论及注意事项

本课题研究初步显示，幼嫩、柔软状态的植物叶片，可利用改良方法进行制片.具体实验流程为：（1）固定：用50%酒精溶液的FAA固定液固定24h以上.（2）脱水与透明：将固定液中的植物材料取出后依次放入30%ALC(30min)→50%ALC(20min)→70%ALC(20min)→85%ALC(20min)→95% ALC(20min)→100%ALC（15min）→100%ALC（15min）；1/2无水乙醇1/2二甲苯混合液（20min）→二甲苯（20min）.（3）浸蜡与包埋：1/2二甲苯1/2蜡屑饱和溶液（置38℃恒温箱中12小时），次日换纯蜡：每隔4h更换一次纯蜡（共换两次）[6].包埋温度设置为62℃.（4）切片与干燥：展片在44℃水浴锅中进行，在37℃烤片机上进行烤片（至少24h后可进行染色处理）.（5）染色与封片：按常规步骤进行.

制片过程还要注意以下事项：

3.1 幼嫩、柔软状态的植物试材比重轻，包埋时不易立稳，故取材时可适当增加材料的切取宽度，以提高包埋环节的材料稳固性.

3.2 包埋应一次完成，防止中间出现温差，造成蜡块包埋不均匀[7].包埋时蜡台、蜡嘴温度设置为60℃、68℃效果较好.包埋过程中所使用的镊子在取材前应进行预热，防止镊子尖端使石蜡凝固，不利于操作.冷却蜡块时不要降温的太快，容易使蜡块变脆，不易进行切片.

3.3 切片成败不仅与切片前的系列处理有关，而且与切片的操作也密切相关.包埋好的蜡块要用刀片去掉周围多余的蜡，将其修整，放在切片机相应位置.切片前要调整好刀片的角度，蜡块切面要保持与刀片平行.在操作过程中，要不断清理刀片及蜡块周围的残蜡，避免蜡带断裂和弯曲.

3.4 展片时水浴锅中最好用蒸馏水，避免杂质浮于蜡带上.

3.5 封片时要根据盖玻片的大小来评估所需树胶的滴数，树胶过多，可在干燥后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去其残余的树胶[8]；若树胶过少，则用玻璃棒加滴树胶在盖玻片的边缘补足.封片时要避免口、鼻对切片呼吸，以免产生雾气，影响切片质量.如果封片时产生气泡，可快速扫过酒精灯火焰，能有效赶出气泡.