瑞舒伐他汀对ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤中Sphk1/S1P/NF-κB信号通路的影响

王晓楠 周 叶 于晓红 高 越

(杭州市第一人民医院老年病科，浙江 杭州 310006)

瑞舒伐他汀对ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤中Sphk1/S1P/NF-κB信号通路的影响

王晓楠 周 叶 于晓红 高 越

(杭州市第一人民医院老年病科，浙江 杭州 310006)

目的 探讨经氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激后，人脐静脉内皮细胞鞘氨醇激酶(Sphk)1、1-磷酸鞘氨醇(S1P)、基质金属蛋白酶(MMP)-3、核转录因子(NF)-κB p65表达的变化及瑞舒伐他汀(Rt)对ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤中Sphk1-S1P信号通路的影响。方法 实验分为空白对照组，ox-LDL(50 μg/ml)处理组，Rt(0.1、1、10 μg/ml)干预组，RT-PCR检测细胞Sphk1、S1P、 MMP-3因子水平；Western印迹检测细胞NF-κB p65蛋白表达；观察药物干预后细胞Sphk1、S1P、MMP-3、NF-κB p65因子的变化。MTT检测细胞增殖活性。结果 ox-LDL处理组细胞Sphk1、S1P、NF-κB p65、MMP-3的表达均显著高于空白对照组(P<0.05)，Rt各干预组较ox-LDL处理组降低(P<0.05)。ox-LDL处理组细胞增殖明显受抑制，Rt各干预组细胞增殖率均较ox-LDL处理组显著上升(P<0.001)。结论 Sphk1-S1P 信号传导通路的激活，导致下游炎症因子NF-κB p65、MMP-3 的高表达，参与ox-LDL 诱导的内皮细胞损伤过程，Rt可能通过抑制Sphk1/S1P 信号传导通路介导的与炎症有关的血管损伤，延缓动脉粥样硬化的进程。

瑞舒伐他汀；动脉粥样硬化；ox-LDL；Sphk1;S1P;NF-κB p65

动脉粥样硬化(AS)是一种炎症性疾病〔1〕，多种信号路径对此炎症反应有启动、维持及抑制作用，其病理表现为血管内皮功能紊乱，单核/巨噬细胞侵入血管壁，吞噬脂质形成泡沫细胞；平滑肌细胞去分化，增殖趋化和迁移加强；血小板激活；粥样斑块内新生血管形成等。近年来研究发现，鞘氨醇激酶(Sphk)1、1-磷酸鞘氨醇(S1P)、核转录因子(NF)-κB p65信号通路在一些伴随炎症性疾病中表达，在炎症、肿瘤、阿尔茨海默病中，S1P都是重要的细胞内靶点，它的作用比既往所了解的更复杂，对于疾病治疗学的进展有重要影响〔2〕。在该信号通路中，NF-κB扮演了重要的炎症“中介”作用，而Sphk1-S1P信号通路在调节细胞迁移、增殖、凋亡等过程中具有重要作用〔3,4〕，且S1P3受体可介导NF-κB激活和促进黏附分子表达〔5〕。本研究旨在观察瑞舒伐他汀(Rt)对人脐静脉内皮细胞损伤中Sphk1/S1P/NF-κB信号通路的影响，探讨其抗As的可能靶点及机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)，Rt(Sigma),F12K培养液(Hyclone),胎牛血清(Hyclone),MTT(Sigma),0.25%胰酶(索来宝),DMSO(Sigma),SYBRGreen PCR试剂盒(Thermo F-415XL),逆转录试剂盒(Thermo #K1622),蛋白酶抑制套装(Roche),BCA蛋白定量试剂盒(Thermo),HRP标记的二抗(联科生物),NF-κB p65一抗(proteintech)等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HUVEC培养在10%胎牛血清DMEM液中，观察ox-LDL及Rt对HUVEC中Sphk1、S1P、NF-κB p65、基质金属蛋白酶(MMP)-3的表达及细胞增殖率的影响。

1.2.2 实验分组 实验分为空白对照组，ox-LDL处理组(50 μg/ml，与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h)、不同浓度Rt组(0.1、1、10 μg/ml Rt干预1 h，再与ox-LDL 50 μg/ml与HUVEC共同培养24 h)。

1.2.3 MTT检测细胞增殖活性 HUVEC以5×103个/孔接种于96孔板，细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱过夜，按照质量比1∶1分别取siRNA与DMN纳米微粒轻轻混匀。室温静置20 min，形成磁性纳米颗粒复合物，在96孔板中每孔加入100 μl新鲜培养液和1 μl复合物并混匀，在37℃、5%CO2培养箱中的10、100、500 mT磁场下培养48 h；将96孔板进行MTT染色，λ=570 nm，测定OD值，计算各组细胞增殖率。

1.2.4 RT-PCR检测 步骤遵循试剂盒说明书，纯化HUVEC的RNA,配制RT反应液，反转录反应条件:37℃ 15 min，85℃ 5 s；引物设计：S1P正义5'-ACGCTGGACGATGGGTT-3',反义5'-CGCCGATGCTGAGGTTTA-3';MMP-3正义5'-AGTTTGCTCAGCCTATCC-3',反义5'-CTGTATGTAAGGTGGGTTT-3'；Sphk1正义5'-GTGCCCGACGAGGACTTT-3',反义5'-CACGCAACCGCTGACCAT-3' ;反应体系：每孔板SYBR Premix Ex Taq 10 μl，PCR正义引物(10 μmol/L)1 μl，PCR反义引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 7 μl混合均匀；使用ABI7500RT-PCR仪，PCR板置于RT-PCR仪上进行PCR反应,预变性：95℃、30 s；40个循环：95℃ 5 s、60℃ 34 s；溶解曲线：95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s。结果数据采用2-△△CT法进行分析。

1.2.5 Western印迹检测 细胞转染：HUVEC以1×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养过夜，取8 μg ST14高表达质粒(10 μl)加入至490 μl无血清的Opti-MEM中，混匀；取5 μl Lipo 2000溶于495 μl无血清的Opti-MEM中，混匀，在室温下孵育5 min；将两种混合物在室温下孵育20 min形成复合物；取1 ml复合物分别加入6孔板，在37℃、5%CO2培养箱中培养6 h后弃上清液并正常培养，37℃、5%CO2培养箱中孵育48 h。细胞蛋白上清液的制备和浓度检测：弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后每孔加入100 μl RIPA裂解液，收集裂解液离心后取部分上清蛋白用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。Western印迹检测总蛋白中目的蛋白表达：行灌胶后，取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度为6 μg/μl和等体积2×上样缓冲液混合，将上样液于100℃沸水中煮沸5 min，再冰上骤冷，3 000 r/min离心1 min；每孔加上样液15 μl，留一孔加10 μl预染的Marker。80 V恒压电泳，约20 min，当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用110 V恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5 cm处时关闭电源，取出胶板；电泳即将结束前，预先将PVDF膜浸泡在甲醇中15 s，然后用ddH2O漂洗2 min，浸泡于转移缓冲液中5 min后进行转膜。转膜结束后，快速取出PVDF膜，放入5%BSA室温封闭2 h；于摇床上用TBST洗膜5 min×3次；孵育袋中加入TBST稀释的NF-κB p65和β-actin 4℃孵育过夜；TBST洗膜5 min×3次，TBST洗膜10 min×3次。膜于化学发光检测试剂反应至暗处出现亮条带，暗室中用X胶片感光、显影、定影。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 各组HUVEC的增殖率比较 ox-LDL处理组HUVEC增殖〔(-24.14±0.18)%〕明显受抑制，与空白对照组〔(100.00±0.11)%〕比较差异有统计学意义(P<0.001)。与ox-LDL处理组比较，Rt 0.1 μg/ml组细胞增殖率〔(12.67±0.20)%〕显著上升；Rt 1 μg/ml和10 μg/ml组〔(24.88±0.13)%，(22.39±0.08)%〕也明显上升，且1 μg/ml组增殖率最大，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.2 各组HUVEC细胞中Sphk1、S1P、MMP-3的表达量比较 与空白对照组比较，ox-LDL处理组及Rt各剂量组Sphk1、S1P、MMP-3的表达量均升高。与ox-LDL处理组比较，Rt各剂量组细胞中Sphk1、S1P、MMP-3表达减低(P<0.05)。Rt 1、10 μg/ml组较Rt 0.1 μg/ml组S1P、MMP-3表达降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞中S1P、MMP-3、 Sphk1基因的相对表达量比较

1)与空白对照组比较，2)与ox-LDL处理组比较，3)与Rt 0.1 μg/ml组比较：均P<0.05

2.3 各组HUVEC中NF-κB p65表达量比较 见图1。与空白对照组(0.068 821)比较，ox-LDL处理组能显著增强NF-κB p65的相对表达量(0.314 125)；与ox-LDL处理组比较，Rt各剂量组NF-κB p65的相对表达量有所下降(Rt 0.1 μg/ml组：0.152 506,Rt 1 μg/ml组：0.112 706，Rt 10 μg/ml组：0.101 093)，并且这种作用随着Rt剂量的提高而加强。

1～5:空白对照组、ox-LDL处理组、Rt 0.1 μg/ml组、Rt 1 μg/ml组、Rt 10 μg/ml组图1 各组细胞NF-κB p65的Western印迹结果

3 讨 论

AS是一种慢性心血管疾病，高脂血症、糖尿病，高血压、吸烟等多种因素均可导致其发生，其发病机制是以脂质浸润学说和损伤反应学说为基础的炎症理论〔6〕。AS 是脂质积累于动脉内壁而形成的局部斑块的病理变化过程，主要经由炎症反应介导，并伴有氧化应激的发生。多种炎症因子之间的相互作用参与了AS的发生、发展、斑块破裂、血栓形成的全过程。

Sphk1 是近年来发现的鞘脂代谢平衡的重要限速酶，Sphk1 催化反应的产物S1P 是一个同时具有细胞内第二信使和细胞外第一信使双重功能的脂类生物活性分子。S1P促AS功能表现为：(1)由S1P3受体介导NF-κB激活和促进黏附分子表达〔5〕；(2)S1P协同凝血酶促进EC3组织因子表达〔7〕。冠脉阻塞患者血清S1P浓度升高，血清S1P水平升高是临床冠脉狭窄发生和严重程度的强指针〔8〕。Alvarez等〔9〕研究发现S1P 通过特异性结合在TRAF2的N-末端RING功能域上，最终激活NF-κB 信号通路。同时有研究发现在AS部位和纤维斑块部位均发现了激活的NF-κB，而正常的血管很少或没有NF-κB表达，证明NF-κB 在AS的发生、发展过程中起重要作用〔10,11〕。NF-κB可以调节一系列基因的表达，并可介导MMPs等的产生。它是细胞因子、黏附分子和生长因子间重要的联络因子，可导致硬化斑块的形成、生长和斑块破裂。本研究表明，Sphk1-S1P 信号通路被异常激活可能参与了AS的病理进程。他汀类药物属于胆固醇生物合成抑制剂，具有降低ox-LDL 的作用，还具备减弱氧化应激和免疫反应的程度，提高内皮细胞功能，稳定动脉粥样斑块等〔12〕。多项临床研究证实〔13，14〕，他汀类药物具有多重的抗感染作用而并非单一的调脂功能。Rt通过抑制炎性趋化因子、黏附分子和炎性细胞因子的表达，降低C反应蛋白(CRP)表达水平，参与改善AS的病理过程。大量研究显示，Rt通过多方面作用发挥抗感染效应：(1)能下调CD40L；(2)亦能通过上调单核细胞过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)-γ，进而下调MMP-9的表达，改善炎性反应；(3)可干预COX-2及前列腺素的合成〔15〕;(4)通过影响循环中单核细胞的TLR-4、CD14表达水平而下调CRP〔16〕。4.抑制INF-γ诱导的巨噬细胞表面主要组织相容抗原(MHC)Ⅱ的表达，并能抑制巨噬细胞表面刺激信号的表达〔17〕；(5)Sironi等〔18〕表明，在脑卒中模型大鼠中，使用Rt干预可降低MCP-1、TGF-β、IL-1、P-选择素的表达水平，从而抑制炎症反应；(6)另外，CCR2可被Rt下调，减轻炎性反应对内皮细胞的损伤作用。

本研究结果显示Rt可通过抑制Sphk1/S1P/NF-κB信号通路，减轻炎症反应，内皮细胞增殖，进而稳定AS斑块，延缓AS斑块的进展。同时也说明了他汀类药物对抗AS炎性反应是通过多种途径实现的。

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〔2016-12-17修回〕

(编辑 滕欣航)

杭州市卫生科技计划项目(2013A17)

高 越(1967-)，男，教授，主要从事老年病研究。

王晓楠(1974-)，女，硕士，副主任医师，主要从事老年心血管病研究。

R54

A

1005-9202(2017)08-1897-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.032