镰形棘豆提取物对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制

武 燕 邓婉蓉 武三卯

(甘肃中医药大学临床医学院，甘肃 定西 743000)

镰形棘豆提取物对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制

武 燕 邓婉蓉 武三卯

(甘肃中医药大学临床医学院，甘肃 定西 743000)

目的 观察镰形棘豆提取物对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用。方法 采用链脲佐菌建立糖尿病模型，通过结扎大鼠左冠状动脉前降支法建立心肌缺血/再灌注损伤模型，再给予镰形棘豆提取物进行保护后，测定血清及心肌的相关生化指标，并采用RT-PCR 法测定组织Caspase-3 mRNA的表达情况。结果 与模型组比较，镰形棘豆保护组的血清及心肌细胞相关生化指标具有显著差异(P<0.05)，且Caspase-3表达明显下调(P<0.05)。结论 镰形棘豆对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤具有一定的保护作用，其机制与镰形棘豆提取物通过抑制Caspase-3 mRNA的表达，清除过量的氧自由基，同时抑制脂质过氧化有关。

镰形棘豆提取物；心肌缺血/再灌注；黄酮；Caspase-3

研究表明，镰形棘豆具有清热解毒，生肌止痛、抗紫外线、抗氧化及抗肿瘤等作用〔1～4〕。糖尿病的发病率逐年上升，已成为心血管疾病的主要的合并疾病之一。有研究表明心肌缺血/再灌注损伤(I/R)后，激发细胞氧化应激，致使有害物质堆积，易导致细胞凋亡和坏死，而细胞凋亡是心肌I/R发病机制中的重要环节〔5〕；同时，糖尿病心肌氧化应激可加重I/R损伤，心肌I/R后产生过量活性氧可进一步加重再灌注后的心肌损伤〔6〕。Caspase-3在凋亡级联反应中处于核心地位，被称为死亡蛋白酶。研究表明心肌I/R时，心肌组织的Caspase-3表达显著提高〔7，8〕。抗氧化剂可以清除大量的自由基，镰形棘豆中含有大量的抗氧化物质〔2，9〕，本文观察镰形棘豆提取物(EOF)对糖尿病大鼠I/R损伤的保护作用。

1 材料与仪器

1.1 药物与试剂 镰形棘豆样品采于甘肃省玛曲县，经甘肃省中医学院药学系鉴定；链脲佐菌素(STZ)购于美国西格玛奥德里奇公司；通心络胶囊购于以岭药业；2′，4′-二羟基查耳酮对照品购自中国药品生物制品检定所；乳酸脱氢酶 (LDH) 测定试剂盒(批号：20120901)、肌磷酸酶(CK) 测定试剂盒 (批号：20120918)、丙二醛(MDA) 测定试剂盒(批号：20120920)、超氧化物歧化酶(SOD) 测定试剂盒(批号：20120903)、谷胱甘肽(GSH) 测定试剂盒(批号：20120920) 均购于南京建成生物制品研究所；Prime ScriptTMRT 试剂盒购自宝生物(大连)有限公司；引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.2 动物及仪器 雄性SD大鼠，体重150～170 g，由兰州大学医学院实验动物中心提供。离心机Z-36HK台式离心机；UV-1800紫外可见分光光度计；DK-98-1型数显恒温水浴锅；BS-224-S型电子分析天平；荧光实时定量PCR仪 (Invitrogen Biotechnology Co.，LTD)；DYY-8B型稳压稳流电泳仪；Image Quant 300凝胶成像系统(GE Health)；1100 HPLC系统(Agilent)。

1.3 方法

1.3.1 镰形棘豆提取物的制备及含量测定 镰形棘豆粉碎后加入圆底烧瓶，加入适量乙醇，加热回流提取3 h后，减压回收乙醇，其成分测定采用高效液相色谱法(HPLC)，首先将提取物用无水乙醇溶解，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，依据文献报道的方法测定EOF中2′，4′-二羟基查耳酮的含量〔9〕。

1.3.2 糖尿病模型建立 大鼠高脂饲料饲养(含10%猪油与90%普通饲料)4 w后禁食12 h，腹腔注射0.1 mmol/L枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液溶解的STZ 50 mg/kg，72 h后采尾血测定血糖。血糖持续≥16.7 mmol/L 达1 w，并出现明显多尿、多饮症状者定为糖尿病大鼠〔10〕。

1.3.3 I/R损伤模型建立 大鼠以乌拉坦腹腔注射麻醉，颈动脉插管，按照文献报道的方法进行〔10〕，建立I/R损伤模型。

1.3.4 分组与给药 糖尿病大鼠被随机分为空白组、I/R模型组，EOF低、中、高(50、100、200 mg·kg-1·d-1)剂量组和阳性对照组，每组8只大鼠。EOF组每天采用EOF不同剂量灌胃处理，I/R模型组用与药物等体积的生理盐水灌胃，阳性对照用通心络胶囊按照100 mg·kg-1·d-1灌胃，连续给药2 w后，颈动脉取血，并分离心脏后用生理盐水清洗。-20℃冰箱保存备用。

1.3.5 血清及心肌生物指标测定 血清及心肌组织的LDH、CK、MDA、SOD、GSH测定依据试剂盒操作进行。

1.3.6 心肌组织Caspase-3 mRNA表达的测定 采用Trizol试剂一步法提取细胞和组织总RNA后依据试剂盒说明合成cDNA，β-actin为内参基因，然后采用半定量RT-PCR检测Caspase-3 mRNA表达。以各基因片段(目的基因)与相应模板β-actin(内参)片段灰度值的比值作为其 mRNA相对表达水平数值(N)。N=目的基因片段的灰度值/对应内参片段灰度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 EOF中2′，4′-二羟基查耳酮的含量 对照品的HPLC如图1所示，测得结果表明EOF中2′，4′-二羟基查耳酮的含量为6.25%。

2.2 EOF对糖尿病I/R大鼠血清指标的影响 与空白组比较，I/R模型组大鼠血清MDA、CK以及LDH明显升高，SOD含量以及GSH活性明显降低(P<0.01)；EOF中、高剂量组能明显减少LDH、CK和MDA，同时提高SOD含量和GSH活性(P<0.01；P<0.05)；阳性对照组各项测定指标与I/R模型组也有显

著差异(P<0.01；P<0.05)，见表1。

图1 对照品的HPLC色谱图表1 EOF对糖尿病I/R大鼠模型血清、心脏组织中相关生化指标的影响±s,n=8)

组别血清LDH(×103U/L)CK(U/ml)MDA(μmol/L)SOD(U/ml)GSH(μmol/L)心脏组织LDH(×103U/L)CK(U/ml)MDA(μmol/L)SOD(U/ml)GSH(μmol/L)空白组3.2±1.30.7±0.26.0±1.042.3±5.296.6±7.96.2±1.51.4±0.26.2±0.656.5±6.3106.6±4.5I/R模型组8.3±1.51)2.3±0.81)10.4±1.71)22.3±2.61)68.5±6.31)10.3±1.31)3.9±0.51)12.4±1.71)30.3±8.11)72.3±5.81)EOF低剂量组5.6±1.81.8±1.38.8±1.628.4±5.373.4±5.98.3±1.52.4±1.210.2±2.246.3±3.980.5±7.1EOF中剂量组4.4±1.42)1.2±0.43)7.2±1.43)35.2±5.62)84.2±5.02)7.9±2.01.9±0.22)8.4±1.23)49.5±4.32)98.3±3.93)EOF高剂量组4.2±1.53)1.2±0.23)6.5±1.33)34.5±3.52)86.5±6.72)6.4±1.03)1.7±0.32)7.5±0.43)52.4±5.52)100.7±7.53)阳性对照组4.0±1.13)0.8±0.32)6.2±0.92)33.3±5.22)85.9±7.32)6.3±1.23)1.4±0.22)7.0±0.82)53.7±4.82)103.2±6.23)

与空白组比较:1)P<0.01；与I/R模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05

2.3 EOF对心肌组织各指标的影响 I/R模型组所有指标与空白组比较有显著差异(P<0.01)；EOF中、高剂量组均能明显减少LDH和MDA，且可显著提高SOD和CK含量以及GSH的活性(P<0.01；P<0.05)；阳性对照组上述各项测定指标与模型组有显著差异(P<0.01；P<0.05)。见表1。

2.4 EOF对I/R大鼠心肌组织Caspase-3 mRNA表达的影响 Caspase-3 mRNA在290 bp左右有一清晰的扩增条带，与空白组比较，Caspase-3 mRNA在I/R模型组显著升高(0.79±0.10 vs 0.46±0.09,P<0.01)，Caspase-3 mRNA在EOF中(0.58±0.12)、高剂量组(0.50±0.08)及阳性对照组(0.49±0.05)中的平均相对含量明显低于I/R模型组(P<0.01；P<0.05)，而在EOF低剂量组(0.72±0.15)中与模型组无差异(P>0.05)。见图2。

1.空白组；2.I/R模型组；3.EOF低剂量组；4.EOF中剂量组；5.EOF高剂量组；6.阳性对照组；7.Marker图2 EOF对糖尿病I/R大鼠Caspase-3 mRNA表达的影响

3 讨 论

EOF含有山奈素、鼠李素和2′，4′-二羟基查耳酮等黄酮类化合物，黄酮类化合物能诱导肝微粒体蛋白及细胞色素P450的合成，具有清除自由基、抑制脂质过氧化等作用〔11〕。本实验研究结果显示EOF对糖尿病大鼠I/R损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能与清除氧自由基、抑制氧自由基产生、抑制脂质过氧化的作用有关。再灌注损伤使得代谢产物增多，大量氧自由基产生，引起细胞脂质化，从而影响细胞膜的流动性，血清MDA水平升高，SOD氧自由基清除能力和GSH 活性下降〔12〕。

因此测定血清中酶如LDH和CK等的活性可评价缺氧所致组织损伤的程度，而GSH、SOD和MDA等是反映脂质过氧化损伤的指标，可间接反映细胞内脂质过氧化损伤的程度。本实验结果发现：EOF中、高剂量组能明显抑制缺血/再灌注损伤所致的血清和心肌中LDH、CK活性的升高，增加心肌细胞和血清中SOD和GSH活性。且EOF中、高剂量能够下调Caspase-3 mRNA的表达，可以推测EOF抗凋亡与下调Caspase-3的mRNA基因表达有关，由此减少自由基的生成和心肌细胞的氧化性损伤，增强了心肌抗氧化能力的同时改善能量代谢，从而起到了对抗心肌缺血再灌注损伤的作用。

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〔2015-12-07修回〕

(编辑 曹梦园)

武三卯(1955-)，男，教授，硕士生导师，主要从事中药药理研究。

武 燕(1981-)，女，讲师，主要从事内科学及分子药理学研究。

R541.4

A

1005-9202(2017)08-1884-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.026