七氟烷复合咪达唑仑麻醉对老年大鼠认知功能的影响及其机制

王建伟 李 佳 曹利艳 米 琰 刘晓飞 张 驰 孙伟鹏

(郑州大学附属肿瘤医院麻醉科，河南 郑州 450008)

七氟烷复合咪达唑仑麻醉对老年大鼠认知功能的影响及其机制

王建伟 李 佳 曹利艳 米 琰 刘晓飞 张 驰1孙伟鹏1

(郑州大学附属肿瘤医院麻醉科，河南 郑州 450008)

目的 探讨七氟烷复合咪达唑仑麻醉对老年大鼠认知功能的影响及其机制。方法 将64只SD大鼠随机分为对照组(C组)、七氟烷组(S组)、咪达唑仑组(M组)、七氟烷复合咪达唑仑组(S+M组)，每组大鼠16只，处理后采用Morris水迷宫实验检测各组大鼠认知功能的变化以及各组大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR)1、NR2B mRNA表达情况、各组大鼠海马神经型一氧化氮合酶(nNOS)、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白表达。结果 Morris水迷宫实验训练1 d，各组大鼠潜伏期比较差异无统计学意义(P>0.05)，训练3 d、5 d，各麻醉组大鼠潜伏期均显著高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)，且S+M组大鼠潜伏期明显高于S组及M组(P<0.05)，差异有统计学意义；将平台撤除后，各麻醉组大鼠60 s内穿过平台次数明显低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)，且S+M组大鼠穿过平台次数明显低于S组及M组，差异有统计学意义(P<0.05)；各组大鼠海马NR1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)，S组与S+M组大鼠海马NR2B mRNA相对表达量较C组、M组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，M组与C组大鼠海马NR2B mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)；与C组比较，各麻醉组大鼠海马nNOS蛋白表达降低，差异有统计学意义，且S+M组大鼠海马nNOS蛋白表达量最低，而各组大鼠海马caspase-3蛋白表达情况无明显变化，差异有统计学意义(P>0.05)。结论 七氟烷复合咪达唑仑可引起大鼠认知功能的降低，其机制可能与抑制NR2B、NOS表达有关，而与神经细胞凋亡无明显关系。

七氟烷；咪达唑仑；认知功能

老年患者术后更易出现人格的改变、记忆力的降低、情绪异常及精神错乱等相关表现〔1,2〕。而这种术后所出现的一系列变化成为术后认知功能障碍(POCD)〔3〕。七氟烷作为一种吸入性麻醉药物，其诱导和苏醒期平稳，具有较强的麻醉效力，且对患者肝肾功能的影响较小，是目前临床上广泛使用的一种麻醉药物〔4〕。本研究探讨七氟烷复合咪达唑仑对老年大鼠认知功能的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取12月龄健康SD大鼠64只，雄性，体质量550～600 g，实验动物由郑州大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂和仪器 吸入用七氟烷(上海恒瑞医药有限公司，H20070172)、咪达唑仑(江苏恩华药业股份有限公司，H20031037)、RNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)、RT-PCR试剂盒(加拿大MBI Fermentas公司)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京天德悦生物科技有限责任公司)、Caspase-3 抗体(Abcam)、神经型一氧化氮合酶(nNOS)抗体(Abcam)、HRP标记的山羊抗兔IgG(北京中衫金桥生物技术有限公司)、引物合成有北京奥科生物技术有限公司完成。Morris恒温水迷宫(张家港市生物医学仪器厂)、DY-89 Ⅱ型电动玻璃匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 造模方法及分组 按照随机数字表法将大鼠分为对照组(C组)、七氟烷组(S组)、咪达唑仑组(M组)、七氟烷复合咪达唑仑组(S+M组)，每组各16只，动物均适应性饲养1 w，让其自由取食饮水，温度22℃，湿度60%～80%。S组、S+M组置于自制的有机玻璃麻醉箱内进行麻醉，对大鼠进行七氟烷吸入麻醉，箱内七氟烷浓度为3.0%，麻醉时间为2 h。C组与M组自由呼吸空气，M组腹腔注射5 mg/kg咪达唑仑，待S+M组从麻醉箱内取出后腹腔注射5 mg/kg咪达唑仑，C组及S组则给予等体积生理盐水腹腔注射。待各组恢复清醒后放置会动物房常规饲养，麻醉处理后的24 h各组随机抽取8只断头处死，在无菌锡箔纸覆盖的冰袋上分离大鼠海马，然后置于液氮中24 h，再转至-80℃冰箱内冻存备用。各组剩余大鼠则于麻醉后24 h开始进行Morris水迷宫实验。

1.4 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫是一个直径120 cm、水深50 cm的圆形铁皮水池。池壁上分布东、南、西、北四个入水点，水池的南北、东西连线将水池分为4个象限，在第4象限正中池壁处放置与水池背景同色的平台，水面较平台高出3 cm。在水中放入脱脂奶粉，使水变浑浊，以隐藏水下的平台，水温控制在(24±1)℃。同时为了视频追踪的需要，在水迷宫中央正上方2 m处放置一台摄像机，以记录动物在水池中的位置、运行的速度以及运动的轨迹。定位航行实验：从任一象限开始，将大鼠按照顺时针方向依次放入4个象限，记录大鼠找到平台的时间即为潜伏期，若大鼠在60 s内仍未找到平台，则将大鼠直接引导至平台上，并让大鼠在平台上适应性停留10 s，且此次实验潜伏期计为60 s。定位航行实验历时5 d，取每日平均值作为大鼠潜伏期成绩。空间探索实验：实验第6天撤去平台，记录大鼠在60 s内穿过平台的次数。

1.5 RT-PCT检测大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)受体NR1、NR2B mRNA表达 各组大鼠分离后的海马组织采用RT-PCR法检测NR1、NR2B mRNA相对表达量。采用Primer 5.0软件设计引物，引物设计如下：NR1(328 bp)上游5'-TCGGTATCAGGAATGCG-3'，下游5'-GGTGCTCGTGTCTTTGG-3'；NR2B(381 bp)上游5'-GCTCAGCGACCTGTATGG-3'，下游5'-TCGTCACTGCGTTCTTTGT-3'；β-actin(448 bp)上游5'-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3'。RNA提取参照试剂盒使用说明书进行，PCR反应条件为NR1：94℃ 45 s、53℃ 45 s、72℃ 45 s，共34个循环；NR2B：94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃ 45 s，共34个循环；β-actin：94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃ 45 s，共30个循环。扩增产物进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外投射仪下观察电泳结果，采用Image J分析软件处理图像，以目标基因条带综合光密度与β-actin条带光密度之间的比值作为目标基因的相对含量。

1.6 Western印迹检测大鼠海马nNOS、caspase-3蛋白表达 分离后的海马组织内加入蛋白提取试剂，4℃条件下离心15 min(12 000 r/min)，并按照BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。配制8%/10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再将蛋白电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉粉笔1 h后加入一抗(分别为1∶2 000稀释的nNOS与1∶4 000稀释的Caspase-3抗体)，4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL化学发光，曝光。

1.7 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析及LSD检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验潜伏期比较 Morris水迷宫实验训练1 d，各组潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)，训练3 d、5 d，各麻醉组潜伏期均显著高于C组(P<0.05)，且S+M组大鼠潜伏期明显高于S组及M组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠Morris水迷宫实验潜伏期比较

与C组比较：1)P<0.05；与S组比较:2)P<0.05；与M组比较:3)P<0.05，下表同

2.2 各组Morris水迷宫实验60 s内穿过平台的次数 将平台撤除后，S组、M组及S+M组麻醉组60 s内穿过平台次数分别为(3.73±1.25)、(4.16±1.09)、(2.36±0.85)次，均明显低于C组(P<0.05)，且S+M组大鼠穿过平台次数明显低于S组及M组(P<0.05)。

2.3 各组大鼠海马NR1、NR2B mRNA表达情况 各组海马NR1 mRNA相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)，S组与S+M组海马NR2B mRNA相对表达量较C组、M组显著降低(P<0.05)，M组与C组大鼠海马NR2B mRNA相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4 各组海马nNOS、caspase-3蛋白表达情况 与C组比较，各麻醉组海马nNOS蛋白表达显著降低(P<0.05)，且S+M组海马nNOS蛋白表达量最低，而各组大鼠海马caspase-3蛋白表达情况无明显变化(P>0.05)，见图1。

表2 各组大鼠海马NR1、NR2B mRNA 相对表达量

图1 各组大鼠海马nNOS、caspase-3蛋白表达

3 讨 论

研究证明〔5，6〕，全身麻醉后大脑发生了基因表达改变、神经元凋亡等广泛而持久的变化，短时间的单纯麻醉即可造成实验动物长时间的认知功能障碍，临床上则主要表现为POCD，其中以老年患者尤为多见。相关调查显示〔7〕，10%～14%的老年患者，经全身麻醉手术后可发生长期的认知功能障碍。七氟烷吸入麻醉是否能引起患者POCD，目前尚无统一的认识，左蕾等〔8〕认为七氟烷对大鼠认知功能的影响具有一定的剂量依赖性，浓度越高则对大鼠认知功能的影响更为严重。

Morris水迷宫实验作为研究空间学习记忆的经典实验，不仅能够反映动物的空间认知，同时还能够有效评价药物干预后对动物学习记忆能力的变化〔9〕。本研究表明七氟烷或咪达唑仑麻醉均对老年大鼠的认知功能具有一定的影响，其中七氟烷复合咪达唑仑对大鼠认知功能的影响更严重。

NR1是NMDAR受体复合物的功能性亚单位，而NMDAR介导一系列高级的神经活动，是构成中枢神经系统学习记忆功能的重要基础，NR1含量可代表NMDA的总量〔10〕。NR2B则是NMDAR调节亚单位，NR2B水平可反映NR受体功能的变化情况〔11〕。本研究表明七氟烷复合咪达唑仑降低海马区NR2B mRNA的表达，提示NR2B表达降低可能与大鼠认知功能降低之间具有密切的联系，这与以往的报道结果相一致〔12〕。

一氧化氮(NO)作为一种神经递质，在神经元之间起着信息传递的作用，尤其在学习记忆过程当中发挥着重要作用〔13〕。由于NO具有不稳定性，目前一般多为一氧化氮合酶(NOS)表示机体内NO活性，相关研究发现〔14〕，老年大鼠记忆减退与其海马区NOS表达降低有关。本研究结果表明七氟烷复合咪达唑仑对鼠认知功能的影响可能与抑制机体NO活性有关。目前一般认为细胞凋亡是一系列高度调控的caspase级联反应的结果，其中caspase-3可有效反映细胞凋亡情况〔15〕，本研究表明七氟烷复合咪达唑仑麻醉对大鼠神经细胞的凋亡影响不大。

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3 Youngblom E,De Palma G,Sands L,etal.The temporal relationship between early postoperative delirium and postoperative cognitive dysfunction in older patients:a prospective cohort study〔J〕.Can J Anaesth,2014;61(12):1084-92.

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8 左 蕾,李琪英,刘丹彦.不同浓度七氟醚对老年大鼠认知功能的影响〔J〕.重庆医科大学学报,2013;38(3):239-43.

9 汤晓红,李依泽,王春艳,等.海马α7nAChR受体在七氟醚麻醉诱发新生大鼠远期认知功能低下中的作用〔J〕.中华麻醉学杂志,2014;34(4):454-7.

10 臧宏刚,朱昭琼,张 超,等.异氟醚麻醉对成年大鼠海马、皮质NR1表达及神经细胞凋亡的影响〔J〕.中华麻醉学杂志,2014;8(3):297-9.

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14 李廷坤,孙亚林,吕帅国,等.石杉碱甲预处理对老年大鼠七氟醚麻醉后认知功能的影响〔J〕.国际麻醉学与复苏杂志,2015;36(6):485-7.

15 董雅洁,高维娟.bcl-2、bax、caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(21):4828-30.

〔2016-12-35修回〕

(编辑 曹梦园)

河南省医学科技攻关计划(No.122300410408)

王建伟(1973-)，男，硕士，主治医师，主要从事疼痛学研究。

R6

A

1005-9202(2017)08-1864-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.018

1 郑州大学医学院