二苯乙烯苷对血管性痴呆大鼠室管膜细胞增殖的影响

马海涵 邵志成 陈力学 邵 阳

(解放军第153中心医院神经内科，河南 郑州 450042)

二苯乙烯苷对血管性痴呆大鼠室管膜细胞增殖的影响

马海涵 邵志成1陈力学1邵 阳2

(解放军第153中心医院神经内科，河南 郑州 450042)

目的 探讨二苯乙烯苷(TSG)对血管性痴呆(VD)大鼠海马血流量和脑室管膜细胞变化的影响。方法 实验分为假手术组、模型组、TSG组，后两组采用4血管阻断法(4-VO法) 建立VD大鼠模型。假手术组麻醉及手术过程与模型组相同，但不电凝双侧椎动脉，不阻断双侧颈总动脉。水迷宫法评价行为学。应用氢清除法检测大鼠海马血流量。用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)免疫荧光染色，显微镜下观察室管膜下区(SVZ)干细胞增殖。结果 与假手术组比较，模型组大鼠学习与记忆能力下降，表现为游全程时间延长，错误次数增加(P<0.01)。手术后7 d，与模型组比较，TSG组海马血流量明显提高和脑室管膜BrdU免疫荧光染色阳性细胞明显增加(P<0.01)。结论 TSG可改善VD大鼠海马血流量和促进脑室管膜细胞增殖。

二苯乙烯苷；血管性痴呆；海马血流量；脑室管膜细胞

研究证实成体动物脑室管膜下区(SVZ)和海马齿状回(SGZ)神经前体细胞可以再生，脑缺血后可以激活SVZ区细胞的增殖，但脑缺血后脑内微环境不太适于增殖细胞的存活以及向神经元方向分化。改善脑内微环境如血流动力学变化等因素，可能有利于SVZ区细胞增殖和分化〔1〕。二苯乙烯苷(TSG)是何首乌的主要成分之一，能够抑制生物膜脂质的过氧化，提高机体超氧化物歧化酶(SOD)的活性〔2,3〕。但TSG能否改善脑组织血流量和促进SVZ区细胞增殖报道较少。本研究观察TSG对血管性痴呆(VD)模型大鼠学习记忆、脑组织血流量和SVZ区细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂、动物及分组 TSG(本室自制，HPLC测定纯度为90%)。健康SD大鼠30只，3～4月龄，雄性，体重200～250 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。实验分为假手术组、模型组、TSG组。TSG组灌胃TSG 60 mg·kg-1·d-1，5 d/w，连续4 w，假手术组与模型组均灌胃等容量生理盐水；造模共6 w后，开始测定。

1.2 模型的建立 采用大鼠四血管阻断法(4-VO法)制成血管性痴呆大鼠模型：将大鼠用10% 的水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上；常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉。用4号丝线结扎。拉紧丝线，同时在距尾尖1 cm处剪断放血约0.3 ml，热凝止血。阻断血流20 min，松开丝扣再灌注10 min后，再次阻断血流20 min，第2次再灌后观察30 min，缝合皮肤，切口局部注射庆大霉素0.2万U。假手术组只分离颈总动脉，穿线但不结扎，尾部不放血。

1.3 行为学检测 采用Morris水迷宫法进行大鼠记忆功能的测定。Morris水迷宫由中国医学科学院生产，为一不锈钢的圆形水池，直径150 cm，高50 cm。池壁标明4个入水点，由此将水池等分为4个象限，任选其中1个象限，正中放置1个直径14 cm、高29 cm的平台。测试程序为定位航行试验：历时5 d，每天上、下午各2次，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其在3 min内寻找到并爬上平台的时间即逃避潜伏期。分别在术后4、8 w重新进行水迷宫实验，大鼠每次在3 min内寻找到并爬上平台的时间为大鼠的记忆成绩，2次/d，连续5 d，计算平均成绩。

1.4 脑组织血流量测定〔4〕按照大鼠脑立体定位图谱，应用氢清除法的测定：应用氢清除法检测大鼠海马血流量。记录电极插入矢状缝旁开2 mm、深3.5 mm、前囟向后2.8 mm处，参考电极放于皮下颞肌旁，大鼠以呼吸机辅助呼吸(70次/min，潮气量2 ml)，待描笔稳定后经气管插管吸入10 %的氢气1 min，记录完整的清除曲线。根据公式计算皮层局部血流量。

1.5 BrdU标记法 各组大鼠于处死前两天按100 mg/kg 腹腔注射BrdU生理盐水液(Sigma公司提供),每日2 次。BrdU免疫荧光染色麻醉动物。4%多聚甲醛400 ml经左心室灌注后，断头取脑，置4%多聚甲醛后固定24 h，冠状位切取以缺血区域为中心的包括侧脑室室管膜下区的脑组织标本，冰冻切片，片厚5 μm，进行BrdU免疫荧光染色，显微镜下观察SVZ区干细胞增殖情况。并在200倍镜下，每只大鼠选5张切片，每张切片取4个视野(单位面积) 计数SVZ区缺血侧和缺血对侧的BrdU阳性细胞数。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1 大鼠行为学变化 与假手术组比较，模型组的游全程时间逐渐延长，错误次数逐渐增加(均P<0.01)。与模型组比较，TSG组学习成绩和记忆成绩均有显著提高(均P<0.01)，表明TSG有提高学习记忆能力的作用，见表1。

表1 TSG对VD模型大鼠水迷宫学习成绩影响

与模型组比较:1)P<0.05

2.2 海马血流量的变化 模型制作后7 d，与假手术组〔(48.5±7.2)ml·min-1·100 g-1〕比较，模型组〔(25.5±3.7)ml·min-1·100 g-1〕和TSG组〔(33.45±3.35)ml·min-1·100 g-1〕海马血流量明显下降(P<0.01)；与模型组比较，TSG组海马血流量明显升高(P<0.01)，表明TSG有提高海马血流量的作用。

2.3 SVZ区BrdU阳性细胞数的变化 见表2。与假手术组比较，模型组和TSG组模型双侧SVZ区均可见BrdU阳性细胞，

表2 TSG对VD模型大鼠SVZ区细胞增殖的 作用,个/点,n=10)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05

主要分布在侧脑室背外侧角和外侧壁。假手术组的BrdU阳性细胞数量少，呈散在分布；模型组和TSG组模型大鼠在手术后3 d，BrdU阳性细胞明显增多，7 d时达到峰值，之后逐渐减少。与模型组比较，TSG组BrdU阳性细胞明显升高(P<0.01)，表明TSG有促进SVZ区细胞增殖的作用。

3 讨 论

由于脑组织反复缺血，导致海马、基底神经结及皮层等结构产生不可逆性损伤，随之出现痴呆症状〔5,6〕。研究显示氧化损伤是导致VD的重要病理因素，脑缺血发生后，缺血缺氧的脑组织通过黄嘌呤氧化酶系统、花生四烯酸-环氧酶系统及线粒体等途径产生大量自由基，由于脑组织生物膜中含有大量的多聚不饱和脂肪酸，因此脑对自由基损害尤为敏感〔7〕。因此自由基的毒性作用已被认为脑缺血损害导致VD的关键性病理环节之一。研究表明，TSG能够抑制生物膜脂质的过氧化，提高机体SOD的活性，从而抑制机体氧应激状态的产生，对VD模型大鼠在学习和记忆能力等行为学以及自由基代谢的产生影响〔3，4，8，9〕。本研究表明TSG能够促进海马组织微循环，提高再灌注，促进SVZ区细胞增殖，改善VD大鼠学习与记忆能力。

1 Kojima T,Hirota Y,Ema M,etal.Subventricular zone-derived neural progenitor cells migrate along a blood vessel scaffold toward the post-stroke striatum〔J〕.Stem Cells,2010;28(3):545-54.

2 Glodzik L,Rusinek H,Pirraglia E,etal.Blood pressure decrease correlates with tau pathology and memory decline in hypertensive elderly〔J〕.Neurobiol Aging,2014;35(1):64-71.

3 Um MY,Choi WH,Aan JY,etal.Protective effect of polygonum multiflorum thromb on amyloid beta-peptide 25-35 induced cognitive deficits in mice〔J〕.J Ethnopharmacol,2006;104(1-2):144-8.

4 Li RP,Wang ZZ,Sun MX,etal.Polydatin protects learning and memory impairments in a rat model of vascular dementia〔J〕.Phytomedicine,2012;19(8-9):677-81.

5 Zimny A,Leszek J,Kiejna A,etal.Analysis of correlation between the degree of cognitive impairment and the results of perfusion CT in patients with dementia〔J〕.Med Sci Monit,2007;13(1):23-30.

6 Tang Z,Pi X,Chen F,etal.Fifty percent reduced-dose cerebral CT perfusion imaging of Alzheimer′s disease:regional blood flow abnormalities〔J〕.Am J Alzheimers Dis Other Dement,2012;27(4):267-74.

7 Moneim AE.Oxidant/antioxidant imbalance and the risk of Alzheimer's disease〔J〕.Curr Alzheimer Res,2015;12(4):335-49.

8 Zhang L,Yu S,Zhang R,etal.Tetrahydroxystilbene glucoside antagonizes age-related α-synuclein overexpression in the hippocampus of APP transgenic mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.Restor Neurol Neurosci,2013;31(1):41-52.

9 Zhou L,Hou Y,Yang Q,etal.Tetrahydroxy stilbene glucoside improves the learning and memory of amyloid-β(1-42)-injected rats and may be connected to synaptic changes in the hippocampus〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2012;90(11):1446-5.

〔2015-05-11修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

四川省杰出青年学科带头人培养基金资助(05ZQ026-020)；四川省科技攻关项目资助(05SG1866)

邵 阳(1968-),男,博士,教授,主要从事神经疾病发病机制研究。

马海涵(1972-)，博士，副主任医师，主要从事脑血管病研究。

R255.2

A

1005-9202(2017)08-1862-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.017

1 重庆医科大学第一附属医院 重庆市神经病学重点实验室 2 南京医科大学第二附属医院神经内科