阴离子表面活性剂降解菌Sp—1的紫外线诱变研究

刘维琦　常立莉　张博　杨佳利+侯宪春

摘要：对已经筛选出阴离子表面活性剂降解菌Sp-1进行紫外线诱变，提高对阴离子表面活性剂月桂醇醚硫酸钠（SLES）的降解率。经过筛选后，选取10株Sp-1的突变菌株，测定Sp-1对SLES的降解率。10株突变菌株的降解率都比原始菌株较高，其中2号突变菌株的降解率为80%。通过对Sp-1紫外线诱变，选取的10株突变菌株对SLES的降解率普遍高于原始菌株，降解效果更为理想。

关键词：降解菌；阴离子表面活性剂；紫外线诱变；降解率

中图分类号：Q93-33 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132001

阴离子表面活性剂具有乳化、增溶、起泡消泡、渗透洗涤、润滑和杀菌等作用，是合成洗涤剂的重要成分。随着现代工业的迅速发展，阴离子表面活性剂通过污水排放和工业废渣等途径进入环境，成为最常见的一类有机污染物。因此对阴离子表面活性剂的检测已经成为我国环保部门的一项重要任务。本实验在原有微生物法降解阴离子表面活性剂的基础之上，通过紫外线诱变进一步提高降解菌的效率。近年来许多学者利用紫外线诱变技术来研究有机氮、苯酚和农药等污染物降解菌的降解特性，但是对于阴离子表面活性剂的降解菌研究目前还鲜见报道。该研究通过对从活性污泥中筛选的阴离子表面活性剂降解菌Sp-1进行紫外线诱变，来探讨诱变菌株对阴离子表面活性剂的降解能力；选取降解性能较高的降解菌，有利于对水环境中阴离子表面活性剂处理工作的进行，同时为阴离子表面活性剂降解菌的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

从活性污泥中提取并经过分离纯化的阴离子表面活性剂降解菌Sp-1。

1.2 培养基

分离培养基采用高氏一号培养基；

筛选培养基采用周理志配方配制；

无机盐培养基为高氏一号改良配方。

1.3 Sp-1生长曲线的测定

将Sp-1接种到SLES浓度为0.1g/L分离培养基中，经过分离纯化后再接种到SLES浓度为0.1g/L的发酵培养基中，在30℃、150 r/min条件下振荡培养24h，每隔2 h取5.0 mL菌液在分光光度计下测出OD460值，并以空白作为对照，绘制Sp-1的生长曲线。

1.4菌悬液的制取

取出Sp-1降解菌的发酵液，用无菌蒸馏水配制菌悬液，分别将菌体浓度稀释到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍，然后用血球计数板观察菌落的个数，取菌落个数100～200之间的浓度为最佳稀释浓度，并以此浓度制备菌悬液。

1.5紫外线诱变

紫外线诱变采用波长为260nm，20W的紫外线杀菌灯。在超净工作台上先将紫外照射灯开启20min杀菌预热，将配制好的菌悬液放置于实验台上，取15个灭菌平板分成5组，每组3个，每个培养基中倒入0.5mL的菌悬液涂布平板，在距紫外照射灯为20cm处，进行紫外照射，5组平板的照射时间依次为30s、60s、90s、120s、150s。以未照射的菌悬液作为对照组，计算诱变致死率。

致死率计算公式：

（1）

1.6Sp-1突变菌株的筛选

1.6.1初筛

选择致死率为75%-80%的Sp-1突变菌株，接种到筛选培养基中，37℃下恒温培养24h。测量蓝色晕圈的直径，用接种针挑选出10个蓝色晕圈直径比原始直径大的Sp-1菌株进行复筛。

1.6.2复筛

将挑选的10株突变菌株和1株原始菌株接种到无机盐培养基上振荡培养48h。在150r/min离心10 min除去菌体；将处理离心后的菌液放在紫外分光光度计中，并分别测量筛选的10株突变菌株对阴离子表面活性剂的降解率。

降解率计算公式：

（2）

2结果与分析

2.1降解菌株Sp-1的生长曲线

在Sp-1降解菌的生长曲线中，可以观察到在12h之前，菌株處于缓慢生长的阶段，从12h后开始逐渐进入对数生长期，当到20h时处于生长较稳定的生长状态，此时菌株对外界环境因素的作用敏感，达到生长的最佳状态，因此应选择培养20h的Sp-1降解菌株进行紫外线诱变处理（见图1）。

2.2不同照射时间对降解菌株的致死效应

由实验结果可知，随着照射时间的不同，SLES降解菌的致死率有所不同。随着照射时间的增加，致死率不断上升，但时间过长会导致致死率上升逐渐缓慢，因此选择90s为紫外诱变剂量时间。致死率为77.3%（见图2）。

2.3微生物降解菌株Sp-1的高效筛选

2.3.1Sp-1降解菌株的初筛

测量接种到筛选培养基中10株Sp-1突变菌株的直径，其中2号突变菌株的直径最大，为1.7mm，对照组菌株为0.6mm（0号菌株为对照组）（见图3）。

2.3.2Sp-1降解菌株的复筛

将菌液离心沉淀，并将菌液的pH调至7保持中性。分别测量10株突变菌株的降解率，经实验结果发现，10株突变菌株的降解率都高于原始菌株的降解率，其中2号突变菌株的降解能力最高，降解率达到80%，比原始菌株的降解率提高了20%（见图4）。

3讨论

对降解菌Sp-1进行紫外线诱变，增加阴离子表面活性剂降解菌Sp-1的降解率，使降解效果达到理想。因紫外线照射剂量目前没有统一的标准，故借鉴曹礼等在研究紫外诱变酿酒酵母时的试验条件，采用20W的紫外照射灯，照射距离为20cm，诱变剂量采用75%-80%的诱变致死率。通过紫外线诱变提高降解菌Sp-1对阴离子表面活性剂的降解率，降解能力增强，使阴离子表面活性剂降解菌Sp-1达到理想降解效果。