耐铅细菌分离鉴定及生物学特性

赵娟娟+吴荣荣+李志涛

摘要：从河北省枣强县受重金属污染的土壤中分离得到2株耐铅细菌，即ZQq1和DYq2，耐受铅离子最高浓度分别为2.0、2.5 mmol/L，经鉴定为芽孢杆菌属。2株菌的生物学特性研究表明，菌株ZQq1和DYq2在pH值4～10之间，盐度不超过10%时能够生长。菌株ZQq1最适pH值为8，最适生长温度42 ℃，最适渗透压为0%；菌株DYq2最适生长温度为42 ℃，最适pH值为8，最适渗透压为1%。

关键词：耐铅细菌；分离鉴定；生物学特性；芽孢杆菌

中图分类号： S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0215-02

伴随着我国工业程度的加深，重金属铅对环境的破坏程度越来越严重。铅可以通过汽车尾气、印染企业废弃物的排放、电池和电子产品的丢弃等各种途径而传递到环境中，进入土壤和地下水中[1]。在被铅污染的水体和土壤中，生长的各种生物通过富集作用，经过食物链传递，最终可以使大量铅进入食物链的顶端包括人类。蓄积在人体内的铅能对血液循环再生系统造成损伤，蓄积到一定的程度时，人就会表现出失眠、噩梦等症状，更有甚者会引起智力下降[2]。

[JP2]研究表明，微生物可降低环境中重金属铅的生物毒性，在用于土壤重金属污染铅的治理等方面的研究均取得了一定的成果[3]。从枣强工业区采集土样，通过逐级分离筛选耐铅细菌并进行形态观察和生理生化测定鉴定。通过对所得菌株的生物学特性研究，可以初步得出菌株对环境的耐受性及在不同环境中的生长趋势，可为以后在用耐铅细菌或与其他方法联合使用时提供理论依據，以实现高效、快速、低成本治理铅污染。[JP]

1材料和方法

1.1材料

土样，来自河北省枣强县受重金属污染的土壤。

1.2设备

超净工作台（SW-CJ-2FD，上海博迅实业有限公司）、振荡培养箱（ZD-85，江苏金坛市医疗器械厂）、恒温生化培养箱（LRH-250，上海一恒科技有限公司）、显微镜（BME，徕卡显微系统上海贸易有限公司）、数码生物显微镜（N-800M，上海旦鼎国际贸易有限公司）、高压灭菌锅（MLS-3750，SANYO）。

1.3耐铅细菌的分离

取0.1 g的土样，接入Pb2+浓度0.01 mmol/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37 ℃、140 r/min条件下进行富集培养。取稀释100倍后的富集菌悬液100 μL涂布在Pb2+浓度为0.02 mmol/L的牛肉膏蛋白胨固体培养基中，每组重复3次，于37 ℃下进行培养，观察菌落生长情况。挑取单菌落在Pb2+浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 mmol/L的牛肉膏蛋白胨固体培养基上逐渐划线分离，经过多次纯化，得到单菌株。将筛选出的菌株接入2.0、2.5、3.0 mmol/L不同浓度的固体培养基中，观察细菌生长状况，并淘汰耐铅能力差的菌株，筛选出耐铅能力最强的菌株[4]。

1.4耐铅细菌鉴定

1.4.1对单菌落的大小、形状等进行观察采用革兰氏染色法对菌株进行染色并观察。

1.4.2生理生化特征

主要包括柠檬酸盐的利用，丙酸盐的利用，氧化酶、接触酶、酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氢酶实验，糖醇发酵、V.P产生、明胶、液化、需氧性测定等[5]。

1.4.3生物学特性试验

1.4.3.1耐铅细菌生长曲线的测定

将菌株活化18 h后接种到液体培养基，37 ℃、转速140 r/min条件下振荡培养。每2 h测定1次细菌菌悬浮液的D600 nm值。

1.4.3.2pH值对耐铅细菌生长的影响

将菌株活化18 h后，分别接入pH值为4、6、7、8、9、10的液体培养基中，37 ℃、转速140 r/min条件下振荡培养24 h。测定不同pH条件下细菌悬浮液的D600 nm值。

1.4.3.3盐度对耐铅细菌生长的影响

将菌株活化18 h后接入0%、1%、2%、4%、5%、7%、10%盐度的培养液，37 ℃、转速140 r/min条件下振荡培养24 h。测定不同盐度条件下细菌悬浮液的D600 nm值。

1.4.3.4不同温度对耐铅细菌生长的影响

将菌株活化 18 h 后接种到液体培养基，在温度分别为4、25、32、37、42、48、50、60 ℃，转速140 r/min条件下振荡培养24 h。测定在不同温度下的细菌悬浮液的D600 nm值。

2结果与分析

2.1耐铅细菌的分离

通过对样品的分离纯化，筛选出2株耐铅能力强的耐铅细菌。1株耐受铅离子浓度最高为2.0 mmol/L，命名为ZQq1，另外1株耐受铅离子最高浓度为2.5 mmol/L，命名为DYq2。

2.2耐铅细菌的鉴定[HT]

2.2.1耐铅细菌菌落特征耐铅细菌菌落特征结果见表1。

2.2.2耐铅细菌生理生化特征

细菌的生理生化特征是鉴定细菌种类的重要指标和依据，结果见表2。

根据表1中2株细菌的菌落形态特征和表2以及2株耐铅细菌的革兰氏染色情况，依据《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版），将2株菌ZQq1和DYq2鉴定为芽孢杆菌属。

2.3耐铅细菌的生物学特性

2.3.1耐铅细菌的生长曲线

从样品中筛选出的2株耐铅细菌ZQq1和DYq2的生长曲线见图1。

由图1可知，ZQq1在2 h内为生长延迟期，18 h附近达到稳定期，在约32 h D600 nm值开始下降，即过了稳定期；DYq2在 2 h 内为生长延迟期，在22 h附近达到稳定期，在约35 h开始进入衰亡期。

2.3.2pH值对耐铅细菌生长的影响

菌株对pH值的适应

力，在一定程度上也表明了菌株对环境的适应能力。pH值对耐铅细菌ZQq1和DYq2生长的影响见图2。由图2可知，ZQq1和DYq2均在弱碱性（pH值约为8）条件下生长最好。ZQq1在pH值为4～8的区间内，随着pH的增大ZQq1生长逐渐变好，当pH值大于10时ZQq1无法生长。DYq2在pH值为4～8的区间内，随着pH值的增大DYq2生长逐渐变好，当pH值小于4时会抑制DYq2菌的生长。

2.3.3盐度对耐铅细菌生长的影响

细菌对不同盐度的适应性差异，可以反映出细菌对环境的适应能力。一般的培养基中也会添加少量盐以维持渗透压。由图3可知盐度对2株耐铅细菌ZQq1和DYq2生长的影响。随着盐度的增加，ZQq1和DYq2生长受抑制程度也在增加。ZQq1最适生长盐度为1%，DYq2最适生长盐度为0。ZQq1耐鹽度极限7%，DYq2耐盐度已达到接近于10%。

2.3.4温度对耐铅细菌生长的影响

不同的温度下细菌的生长速率不同，从中也体现出了细菌对生长环境的一定适应能力。温度对耐铅细菌ZQq1和DYq2的生长影响见图4。由图4可知，随着温度的增加2株菌的生长速率均提高，约42 ℃为最适生长温度，ZQq1在4～20 ℃区间范围内，生长速率变化比较平缓，而在20～40 ℃区间变化较大，随着温度升高曲线变得平缓，之后陡然下降，在50 ℃时不能生长，而DYq2在4 ℃到最适合生长温度之间变化趋势相同，过了最适生长温度下降明显，在60 ℃时生长被抑制。[HT]

3结论

[JP2]从河北省枣强县受重金属污染的土壤中分离出2株耐铅能力较强的耐铅细菌，即ZQq1和DYq2。分别从以下进行描述：（1）ZQq1的菌落边缘整齐，表面光滑，乳白色。菌体杆状，产生芽孢，革兰氏阳性，具有运动性，好氧生长，经鉴定为芽孢杆菌属菌。其在pH值为弱碱性条件下生长最好，在pH值大于10时或小于4时不能生长，最适生长温度在42 ℃附近，在50 ℃及以上不能生长，其菌株在盐度为7%及以上完全抑制生长，耐受铅离子浓度最高2 mmol/L。（2）DYq2的菌落边缘整齐，表面光滑，乳白色。菌体杆状，产生芽孢，革兰氏阳性菌，具有运动性，好氧生长，菌体有成链趋势，经鉴定为芽孢杆菌属菌。DYq2在pH值为8时生长最好，其能在42 ℃条件下生长，在 60 ℃ 及以上不能生长，其菌株不耐盐，在盐度10%及以上完全抑制生长，耐受铅离子浓度最高为 2.5 mmol/L。

参考文献：

[1]李宏，江澜. 土壤重金属污染的微生物修复研究进展[J]. 贵州农业科学，2009，37（7）：72-74.

[2]高文谦，陈玉福. 铅污染土壤修复技术研究进展及发展趋势[J]. 有色金属，2011，63（1）：131-136.

[3]骆永明. 污染土壤修复技术研究现状与趋势[J]. 化学进展，2009（2）：558-565.

[4]陈美标，郭建华，姚青，等. 大宝山矿区耐Cd2+细菌的分离鉴定及其生物学特性[J]. 微生物学通报，2012，39（12）：1720-1733.

[5]江春玉，盛下放，何琳燕，等. 1株铅镉抗性菌株WS34的生物学特性及其对植物修复铅镉污染土壤的强化作用[J]. 环境科学学报，2008，28（10）：1961-1968.