柚皮黄酮的提取工艺及红外光谱分析

余先纯 +王向军

摘要：采用微波联合酶法提取柚皮黄酮，探讨了微波功率、微波处理时间、酶解温度、酶液用量、酶解时间和缓冲液pH值对黄酮提取率的影响，并通过正交试验对提取工艺进行优化。红外光谱分析显示，提取物为典型的黄酮类化合物。正交试验结果表明，在微波功率350 W、微波处理时间10 min、酶解时间90 min、酶液用量0.9%（m/m）、酶提取温度 55 ℃ 和缓冲液pH值4.5的条件下，黄酮的提取率可达到5.93%。

关键词：柚皮黄酮；微波处理；酶法；红外光谱

中图分类号： TS201.1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0137-03

柚皮是丰富廉价的果实废弃物，其中除了含有丰富的芳香油、果胶、色素外，还有经济价值很高的橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等生物类黄酮物质[1]，柚皮中的黄酮具有抗氧化、抗菌、抗突变、抗肿瘤等多种作用，广泛用于医药、食品及美容等行业[2]。传统的提取方法多为溶剂提取法，但提取时间长、产品活性及纯度低。而酶法提取技术与微波联合提取法在许多方面发挥着独特的优势。其中酶法提取条件温和、能耗低、无污染[3]，但提取速度慢。微波辅助提取是利用微波场的特性和优点来强化天然产物有效物质浸出的提取方法。它具有提取效率高、消耗溶剂少、提取时间短等优点[4]。因此，采用微波联合酶法提取技术，可以在低温环境下加速胞内物质溶出，节省提取时间、加快反应速率和提高产率。

目前，关于利用微波联合酶法提取柚皮黄酮的研究报道还不多见。本研究以柚皮为原料，采用微波联合酶法联用技术提取柚皮黄酮，并利用正交试验对提取工艺进行优化，以获取最佳的提取工艺。

1材料与方法

1.1材料

柚皮从水果市场购得；纤维素酶，诺维信（中国）生物技术有限公司；芸香苷标准样品（美国Sigma公司）；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。

FH102微型植物试样粉碎机（湖北省黄骅市齐家务科学仪器厂）；SHZ-82数显水浴恒温振荡器（江苏科兴电器有限公司）；MAS-Ⅱ型常压微波合成/萃取反应工作站（上海新仪微波化学科技有限公司）；傅立叶变换红外光谱仪（Varian 2000，中国）。

1.2方法[HT]

1.2.1柚皮预处理

用蒸馏水将柚皮洗净后放入鼓风干燥箱，在80 ℃恒温干燥3 h，再用微型植物试样粉碎机破碎至60目。取柚皮粉末3.0 g，按1 ∶[KG-*3]18的料液比后置于常压微波合成/萃取反应工作站，在设定的功率下处理一段时间后冷却至40 ℃，得到预处理液。

1.2.2柚皮黄酮的提取

在预处理液中加入一定质量分数的纤维素酶，加入200 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液[5]，调节pH值后置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，在一定的温度下提取一定时间，再冰浴冷却至常温，然后减压、抽滤，得到柚皮黄酮提取液。同时，采取在无微波辅助条件下进行的对比试验。

1.2.3柚皮黄酮的分析

样品总黄酮含量的测定参照参考文献[6]方法进行。

黄酮提取率按照（1）式计算：

[JZ（]黄酮提取率=[SX（]总黄铜质量桔皮粉质量[SX）]×100%。[JZ）][JY]（1）

2结果与分析

2.1单因素试验

在探索性试验的基础上，以柚皮黄酮的提取率为指标，采用单因素试验，考察微波处理时间、微波功率、酶解温度、酶液用量、酶解时间和缓冲液pH值对黄酮提取率的影响，以确定提取黄酮的最佳条件。

2.1.1微波处理时间和功率的影响

在酶解温度55 ℃、酶液用量0.8%、酶解时间90 min和缓冲液pH值为4.5条件下，设置微波功率分别为200、250、300、350 W。由图1可知，微波功率对黄酮提取率的影响很大，功率低时，黄酮提取率较低；随着功率的升高，黄酮提取率不断升高，但10 min后，功率为300 W的提取率与350 W的相接近，考虑到生产成本，将功率确定为300 W。同时，当功率为300 W时，10 min后，黄酮提取率增幅趋缓，随着时间的延长，提取率曲线几乎接近水平，这是因为微波加热能使有液泡类的细胞瞬间膨胀破碎，使胞内物质释放出来，在提取初期，时间越长，胞内物质释放物越多[7]，黄酮的提取率也就越高，随着时间的延长，胞内释放物的含量逐步减少，黄酮提取率增加不明显。故将微波处理时间确定为10 min。

2.1.2酶解温度和酶液用量对提取率的影响

在微波功率300 W、微波處理时间10 min、酶解时间90 min和缓冲液pH值为4.5的条件下进行试验，设置酶解温度45、50、55、 60 ℃。由图2可知，相同条件下，酶解温度为55 ℃时提取率最高，因此在本试验中选取55 ℃为酶法提取温度。在55 ℃时，酶液用量低于0.8%时，随着酶液用量的增加，柚皮黄酮提取率明显增加，当酶液用量超过此值时，黄酮提取率增加缓慢。

2.1.3缓冲液pH值和酶解时间对提取率的影响

选取微波功率[KG*8]300[KG*3]W、微波处理时间[KG*8]10[KG*3]min、酶解温度[KG*8]55[KG*3]℃[KG*8]及酶液

用量0.8%，考察不同酶解时间和缓冲液不同pH值对黄酮提取率的影响，由图3可知，在酶解时间为90 min、缓冲液pH值约为4.5时，柚皮黄酮提取率较高，而pH值低于或超过 4.5 后提取率均较小。这可能是由于pH值约为4.5时酶的活性较好的缘故，因此确定pH值为4.5。随着提取时间的延长，黄酮提取率逐渐增加，当酶解时间超过90 min后再延长提取时间，黄酮提取率降低，故选择90 min作为酶解时间。

2.2正交试验分析

为了使提取黄酮提取工艺更加科学和合理，在进行单因素试验的基础上，取提取液pH值为4.5，采用L16（45）多因素正交试验对提取黄酮的微波功率、微波处理时间、酶解时间、酶液用量和酶提取温度5个有重要影响的因素进行设计，见表1。

根据正交试验结果显示：影响黄酮提取率的因素顺序为B>A>D>C>E，工艺的最佳组合为B2A4D2C2E2，即微波功率350 W、微波处理时间10 min、酶解时间90 min、酶液用量0.9%和酶提取温度55 ℃。按上述最优条件追加3次试验，提取柚皮黄酮的平均提取率为5.93%。而在其他工艺条件相同，但无微波的条件下，采用酶法提取法，黄酮的提取率仅为4.24%，酶解时间240 min。因此，可见微波有利于提高黄酮的提取率及加快提取速度。

2.3红外光谱分析

由于天然黄酮类化合物母核上常含有烃氧基、甲氧基、异戊烯氧基和羟基等基团，其红外光谱在3 100～3 460 cm-1、1 600～1 640 cm-1，以及1 372、1 242、1 058 cm-1的振动峰可代表黄酮类化合物的特征峰。

由图4可知，柚皮黄酮红外谱在3 390 cm-1附近有羟基缔合形成宽而强的吸收峰，说明有大量的酚羟基或糖上的羟基存在；同时，在2 932、2 862、1 370 cm-1附近有较强的表征2-[CM（23*2]和3-的吸收峰出现，证明饱和碳上的氢较多；而在

1 740 cm-1 附近由酯羰基（C—O）引起的伸缩振动峰虽然较弱，但在1 646 cm-1附近仍然有羰基的伸缩振动峰出现；此外，在1 646、1 518～1 322 cm-1范围内有若干表征苯环的吸收峰存在；且在1 320～1 158 cm-1有由羟基的弯曲振动引起的吸收峰出现；而在1 246和1 060 cm-1附近也出现了C—O—C 的反对称和对称伸缩振动峰；最后，在890～700 cm-1附近还出现了苯环上取代基位置引起的吸收峰。以上特征峰的出现，均说明提取物为典型的黄酮类化合物。

3结论与讨论

采用微波辅助酶法提取柚皮黄酮，微波的使用有利于提高黄酮的提取量和加快提取速度，而酶法的使用可以降低较高温度对黄酮生物活性的影响。微波的功率、微波处理时间、缓冲液的pH值以及提取温度、时间和酶液用量等因素均对黄酮的提取量有较大影响。

在缓冲液pH值为4.5的情况下，经过正交试验优化后的提取工艺条件为：微波功率350 W、微波处理时间10 min、酶解时间90 min、酶液用量0.9%和酶提取温度55 ℃，柚皮黄酮的提取率可达5.93%。

红外光谱分析显示，采用本方法所得到的提取物为典型的黄酮类化合物。

参考文献：

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