毛竹组织培养中成熟种子消毒方法

2017-05-08江涛李晨曦陈磊杨兆河苏军刘伯斌

江苏农业科学 2017年4期

江涛+李晨曦+陈磊+杨兆河+苏军+刘伯斌

摘要：成熟毛竹种子污染严重和萌发率低是制约毛竹组织培养发展的关键因素。研究发现氯气消毒优于常规的次氯酸钠和高锰酸钾消毒法。试验结果表明，氯气消毒毛竹种子未污染率、萌发率分别可达45.60%±2.06%、3330%±5.51%，极显著高于次氯酸钠和高锰酸钾消毒法；并且进一步优化试验条件，经过1 d浸种，在0.01 mol/L氯气浓度下处理7 h，毛竹种子的未污染率、萌发率分别可达96.23%±0.19%、74.00%±1.89%；且以氯气消毒的種子能发育成实生苗和进行愈伤组织的诱导。成熟毛竹种子的氯气消毒方法，可为今后更好地利用毛竹种子进行组织培养研究奠定基础。

关键词：氯气；毛竹；组织培养；未污染率；萌发率

中图分类号：S795.705文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2017）04-0103-03

中国毛竹（Phyllostachys heterocycla cv.pubescens）是一种重要的经济竹种，具有分布广、种植面积大、蓄积量多等特点，具有重要的生态功能和经济社会价值[1]。目前，生产上主要采用移母竹的繁殖方式，其生产成本高，繁殖率低，很难满足造林地需求[2-3]，通过组织培养进行快速繁殖被认为是发展竹类的新途径[4]，有利于进一步开展基因工程育种。

毛竹组织培养一直是毛竹产业发展的瓶颈[5]。目前，毛竹组织培养采用的外植体多为种子、鞭笋、冬笋及春笋。以毛竹笋为外植体容易消毒灭菌，但是组织培养中褐化现象严重，且取材受季节限制[6-8]。已有报道以成熟种子经过愈伤组织成功诱导出不定芽[9]，有研究发现成熟种子可以在液氮中直接保存[10]，从而能使成熟种子长期保存。以成熟毛竹种子为外植体进行组织培养研究不受季节限制，是优良的组织培养材料[11]。李楠等研究发现，毛竹种子胚乳易受真菌污染，使得在无菌操作中污染率较高[12-13]，极大地增加工作量，故在无菌操作中控制污染成为毛竹组织培养中的关键步骤之一[14]。为了解决毛竹种子在组织培养过程中无菌操作难的问题，本研究拟通过对不同的消毒方法进行比较，在此基础上进一步优化消毒、萌发条件，以期解决毛竹种子消毒难和萌发率低的问题，为今后更好地利用毛竹种子进行组织培养研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料[HT]

毛竹种子为福建省林业科学研究院提供的当年采收的毛竹种子，挑选出饱满且没有霉变的种子作为试验材料。

1.2方法

1.2.1外植体消毒方法

（1）高锰酸钾消毒法。预处理后毛竹种子浸泡在3%高锰酸钾溶液中消毒2 h，用无菌水清洗5次，每次7 min，用无菌滤纸吸干水分后，接种于MS培养基中培养观察，15 d后统计未污染率、萌发率。（2）次氯酸钠消毒法。预处理后的毛竹种子浸泡在30%次氯酸钠溶液中消毒40 min，用无菌水清洗5次，每次7 min，用无菌滤纸吸干水分后，接种于MS培养基中培养观察，15 d后统计未污染率、萌发率。（3）氯气消毒法。100 mL 10%次氯酸钠与5 mL 36%浓盐酸制备氯气[15]，将去皮后的毛竹种子置入大培养皿中，然后在密闭的容器中，0.01 mol/L的氯气浓度下消毒5 h后，接种于MS培养基中培养，15 d后统计未污染率和萌发率。

1.2.2毛竹种子浸泡处理

在氯气消毒方法中，将毛竹种子分别浸在水中0、1、2、3 d后，在0.01 mol/L的氯气浓度下消毒5 h，接种于MS培养基中培养观察，15 d后统计未污染率和萌发率。

1.2.3氯气消毒浓度与时间组合选择

本试验选择3种氯气浓度，分别为0.005、0.01、0.02 mol/L；选择1、3、5、7、9 h 5个梯度消毒时间（表1）。将浓度与时间进行组合处理，消毒后的毛竹种子接种于MS培养基中培养，15 d后统计未污染率、萌发率。

1.2.4赤霉素处理

赤霉素有助于种子萌发。首先冲洗种子2 h，浸种2 d，200 mg/L赤霉素浸种2 h，然后在密闭的容器中，0.01 mol/L的氯气浓度下消毒5 h，接种于MS培养基中培养，15 d后统计未污染率、萌发率。

1.3培养基和培养条件

基本培养基MS，添加蔗糖30 g/L，琼脂9 g/L，pH值 5.8，121 ℃灭菌20 min。外植体通过以上方法消毒灭菌后，接种于含1 mL MS培养基的2 mL离心管中。由于毛竹种子污染严重，为避免种子交叉污染，每个离心管中放入1粒种子，每个试验3次重复，每个重复使用500粒种子，25 ℃黑暗

培养，15 d后统计未污染率、萌发率。愈伤组织诱导培养基为MS+500 mg/L Pro+500 mg/L Gln+300 mg/L +4 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L ZT，继代培养基为MS+2.5 mg/L 2，4-D。

1.4数据分析

未污染率、萌发率按如下公式进行计算：未污染率=（未污染数/总接种数）×100%；萌发率=（萌发数/总接种数）×100%。所有数据均通过Excel 2003和SPSS 19.0软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1毛竹种子消毒方法的选择

在组织培养中，常用消毒试剂有氯化汞、次氯酸钠、高锰酸钾，氯化汞由于会对环境产生影响，而很少使用。氯气作为一种广谱的消毒剂，具有很强的渗透和杀菌能力，本研究首先采用毛竹干种子，通过对高锰酸钾、次氯酸钠、氯气3种消毒方法比较，结果采用高锰酸钾消毒方法，未污染率、萌发率分别为（3.23±0.88）%、（2.46±0.57）%；采用次氯酸钠消毒方法，未污染率、萌发率分别为（15.17±1.20）%、（23.66±4.58）%；采用氯气消毒未污染率、萌发率分别可达（45.60±2.06）%、（33.30±5.51）%（图1-A），氯气消毒方法毛竹种子未污染率极显著高于高锰酸钾、次氯酸钠消毒方法，能有效抑制真菌污染，且经氯气消毒的种子能正常萌发（图1-B），结果表明，与次氯酸钠、高锰酸钾消毒比较，氯气消毒是较优的毛竹种子消毒方法。

2.2浸泡时间对毛竹种子未污染率、萌发率的影响

真菌孢子具有特殊的结构，在消毒中很难被杀死，可能是造成毛竹种子消毒困难的原因之一。而在孢子萌发成营养体后消毒，则可以提高消毒效果。为了提高氯气消毒毛竹种子的未污染率，本研究将在毛竹种子浸泡在水中0、1、2、3 d后再进行氯气消毒，发现浸种1 d后的毛竹种子未污染率、萌发率分别为（97.27±0.34）%、（65.47±0.57）%（图2），极显著高于干种子和浸泡时间为2、3 d的种子，结果表明，水中浸种毛竹种子1 d可以提高氯气消毒的效果。

2.3赤霉素处理对毛竹种子未污染率、萌发率的影響

赤霉素能促进种子萌发，在农林业中得到广泛应用。为了提高成熟毛竹种子的萌发率，本研究将浸种2 d的毛竹种子用200 mg/L赤霉素处理，以未进行赤霉素处理的种子为对照。结果表明，通过赤霉素处理后的毛竹种子萌发率可达（70.40±1.88）%，极显著高于未经过赤霉素处理的毛竹种子；未进行赤霉素处理的种子污染率稍有提高，但差异不显著（图[CM（24*3]3）。表明毛竹成熟种子组织培养过程中，可采用赤霉素

处理促进毛竹种子萌发。

2.4氯气不同浓度和消毒时间对毛竹种子未污染率、萌发率的影响[HT]

浸种后再进行氯气消毒可能会对毛竹种子造成伤害，从而影响萌发率。本研究对氯气不同浓度和消毒时间进行进一步优化，试验结果（图4）表明，在0.005[KG*3]mol/L的氯气浓度

下，随着消毒时间延长，未污染率提高，而萌发率没有显著变化，经过9 h

[JP2]消毒未污染率、萌发率分别达到（18.00±163）%、（4423±[JP]2.56）%；在0.01 mol/L氯气浓度下，随着消毒时间延长，未污染率提高，最高可达（98.23±0.78）%，随着氯气处理时间的延长，萌发率先上升后下降，经过7 h消毒未污染率、萌发率分别达到（96.23±0.19）%、（7400±189）%，延长消毒时间至9 h，未污染率没有显著性提高，但是萌发率急剧下降至30%左右；当进一步增加氯气浓度，在 3 h 未污染率、萌发率达最高，分别为（86.00±1.89）%、（62.90±2.70）%，但进一步延长消毒时间，萌发率极显著下降，在消毒9 h时，萌发率仅为（5.00±125）%，表明增加氯气浓度、延长氯气消毒时间会提高未污染率，同时也会抑制种子萌发。结果采用001 mol/L浓度的氯气，处理7 h，是最适当的消毒组合方法。

2.5氯气消毒的毛竹种子成功诱导愈伤组织和无菌苗

氯气消毒的毛竹种子能正常萌发，为验证氯气消毒会不会影响后期愈伤组织诱导和对实生苗产生影响，本研究进一步将所获得萌发的毛竹种子接种至愈伤组织诱导培养基中进行培养，25 d后发现萌发的毛竹种子在根和下胚轴部分膨大，产生致密淡黄色的愈伤组织（图5-A），经过50 d的进一步继代培养，能成功诱导出颜色淡黄、疏松的胚性愈伤组织（图5-B），进一步继代诱导30 d可以发现有类似体胚的组织形成（图5-C）。然后在接下来的4个月的继代培养中，发现胚状体分化出不定芽。除此之外，将萌发的种子直接接种MS培养基，可以形成正常的实生无菌苗（图5-D）并且可以进行扩繁。表明氯气消毒法不会对后续的愈伤组织诱导和实生苗的培养造成影响。

3结论与讨论

毛竹种子表面和胚乳中伴生着真菌[6]，毛竹组织培养中，种子消毒是关键的第一步。在常规消毒方法中，氯化汞为剧毒物质，会对环境产生一定危害[14]，乙醇和次氯酸钠消毒法被认为是毛竹外植体消毒的主要方法，但是效果欠佳[15]。本研究首先通过次氯酸钠和盐酸制备产生氯气与常规次氯酸钠和高锰酸钾的消毒方法比较，结果氯气消毒效果显著高于[JP2]次氯酸钠、高锰酸钾，未污染率、萌发率分别可以达到（4560±[JP]2.06）%、（33.30±5.51）%，这可能是由于氯气具有很强的渗透能力[16]，能杀死隐藏于毛竹种子腹缝沟中的真

菌，从而提高其杀菌效果。经过1[KG*3]d的浸种，再使用氯气处理，未污染率、萌发率分别可达（97.27±0.34）%、（6547±0.57）%，

极大提高了毛竹种子未污染率、萌发率。可能经过 1 d 浸种，真菌孢子在合适的温湿度条件下开始萌发成营养体[17]而增强氯气消毒效果。为了进一步提高毛竹种子萌发率，优化氯气浓度和消毒时间，0.01 mol/L的氯气浓度下，经过7 h处理，未污染率、萌发率分别可达（9623±0.19）%、（74.00±1.89）%，再次提高毛竹种子的萌发率，远高于李楠等的研究结果[12，15]，并且还可使用赤霉素处理进一步提高萌发率，经过氯气消毒后的成熟毛竹种子可以成功诱导出愈伤组织和实生苗。本研究解决了毛竹种子在组织培养过程中污染严重和萌发率低的问题，为今后毛竹高效再生体系的建立和基因工程研究奠定了基础。

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