甘蔗离体抗旱突变体的筛选及生理特性

蒙秋伊+罗凯+刘鹏飞+张正学

摘要：用0.2%甲基磺酸乙酯（EMS）处理黔糖5号甘蔗愈伤组织4 h，在100 g/L PEG胁迫下进行抗旱性突变体筛选，得到抗旱诱变植株。在盆栽条件下对抗旱突变体进行干旱胁迫，测定甘蔗幼苗叶片的质膜透性、叶绿素荧光参数等相关生理指标。结果表明，突变株系的最大光化学效率（Fv/Fm）增强，游离脯氨酸含量、叶绿素含量维持高水平，丙二醛（MDA）含量减少，细胞膜透性减小。对抗旱指标叶绿素荧光参数、相对电导率、MDA含量、脯氨酸含量、叶绿素含量等进行综合评价，诱变植株B1、B2、B5各项抗旱指标靠前。说明经EMS诱变和PEG筛选得到的抗性植株在耐旱性方面比对照强，筛选的甘蔗突变体比对照具有更强的抗旱性。

关键词：甘蔗；诱变；抗旱突变体；生理特性；愈伤组织；叶绿素荧光参数

中图分类号： S566.103.4文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0099-04

贵州蔗区多为旱坡地，缺乏灌溉条件，旱灾频发，严重制约产业发展和蔗农增收。培育节水抗旱、丰产优质的甘蔗新品种，是解决干旱问题经济有效的手段之一。创造耐旱资源的方法很多，除自然变异外，还有太空诱变、射线诱变、化学诱变等[1]，其中化学诱变由于技术简单，引起的变异丰富，受到育种界广泛关注。Nilan等用硫酸二乙酯（DES）处理大麦种子，育成了产量高、茎秆矮、抗倒伏的品种Luther[2]。此后，农作物化学诱变育种在世界各国得以推广，到1990年为止，利用化学诱变育成的新品种（系）有106个，约占诱变育成品种（系）的7%，以禾谷类居多，其中大麦l5个、水稻12个、小麦9个、玉米7个[3]。付凤玲等用 60Co γ射线和叠氮化钠（NaN3）处理玉米愈伤组织，经过1.0% NaCl高渗培养基筛选，得到1个耐旱性与耐旱自交系81565接近的株系，并从M1代株系中发现了1个细胞核隐性单基因控制的孢子体雄性不育的雄性不育株[4]。陈丽等通过甲基磺酸乙酯（EMS）处理杨树胚性愈伤组织定向筛选耐盐突变体，获得耐盐性明显比对照高的突变体株系[5]。许莉萍等以磷酸盐为选择剂，从高产低糖的甘蔗品种中筛选出稳定的磷酸盐抗性细胞系，其再生植株群体含糖量较对照高[6]。甘蔗体细胞无性系耐旱突变体的研究结果如下，Yadav等在不同NaCl浓度和聚乙二醇（PEG） 8000作用下，离体选择经辐射诱变的CoC671体细胞无性系，得到耐盐性和抗旱性增强的突变体[7]。这些研究表明经过物理化学诱变后，在一定的选择压力下可以从产生的变异体中筛选出抗旱性强的细胞系。本试验利用甘蔗离体培养，结合EMS诱变和PEG定向筛选技术，以期获得甘蔗育种的中间材料，为以后选育抗旱性强的甘蔗新品种提供育种材料。

1材料与方法

1.1材料

试验材料为黔糖5号甘蔗。化学诱变剂为美国SIGMA公司生产的甲基磺酸乙酯（EMS）。

1.2试验方法

1.2.1材料处理

取甘蔗茎梢幼叶为外植体，用自来水洗净，剥去几层，留下长7～8 cm、直径1.5～2.0 cm的嫩叶梢；用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3～5次；再用0.1% HgCl2消毒10 min，无菌水冲洗3～5次；在无菌滤纸上吸干表面的水，再切去两端，剥去2～3层，留下长4～5 cm、直径0.5～1.0 cm 的嫩叶梢，横切成0.5～1.0 mm厚的圆形薄片，接入诱导培养基培养。

1.2.2培养条件及培养基

诱导培养基为MS+2.0 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉；分化培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉；生根培养基为1/2MS+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L PP333+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉。诱导愈伤组织在25 ℃下暗培养，分化及生根培养温度为25 ℃，光照时间12 h/d，光照度为1 500 lx。

1.2.3甘蔗愈伤组织的EMS诱变处理

用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH值7.0）配制浓度为0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的EMS溶液，过滤灭菌，以不含EMS的磷酸缓冲液处理为对照。取黔糖5号甘蔗愈伤组织用EMS溶液浸泡，每个浓度下分别浸泡2、4、6、8 h后，无菌水冲洗，再接种于诱导培养基恢复，一共24个处理，每个处理6皿。愈伤组织接种于诱导培养基暗培养3～5 d后转入分化培养基诱导分化，25 d统计分化率，确定EMS 50%致死剂量。

[JZ]愈伤分化率=分化苗数/接种愈伤组织块数×100%；

[JZ]愈伤相对分化率=处理分化率/对照分化率×100%。

1.2.4选择剂PEG浓度的确定

采用PEG 6000模拟干旱胁迫，配制PEG浓度为0、20、40、60、80、100 g/L的1/2 MS培养基，以未经诱变处理的黔糖5号甘蔗分化苗为材料，每处理分别接种50株于上述培养基中，重复3次，培养30 d观察生根情况，确定PEG处理临界浓度。

[JZ]生根率=生根的外植体数/接种的外植体数×100%。

1.2.5抗旱突变体的筛选

将经EMS处理后的突变体植株进行PEG胁迫，接种到含100 g/L PEG的1/2MS生根培养基中，进行抗旱筛选，25 ℃条件下培养30 d，再观察其生根情况。根据根系发育情况判斷其抗旱性强弱，其中根系生长势强的为抗旱植株，完全不生根的为不抗旱植株。

1.2.6干旱胁迫处理

将黔糖5号甘蔗突变体株系移栽至盆钵，以同期分化出的未处理的组培再生苗为对照，定量供水保持土壤水分一致性，生长盛期时停止浇水，停止浇水前采样测定一次抗旱性生理指标；10 d后土壤表面发白，甘蔗叶片部分卷曲，叶间部分枯萎，清晨无吐水现象，再次采样进行抗旱性生理指标测定。

1.2.7抗旱突变体株系的生理生化鉴定

用FMS-1脉冲调制式荧光仪测定+1位叶最大光化学效率（Fv/Fm），采用电导率法[8]测定质膜透性，用硫代巴比妥酸法[9]测定丙二醛（MDA）含量，采用张宪政的方法[10]测定叶绿素含量，采用酸性茚三酮法测定脯氨酸含量。

1.2.8数据处理

所有数据均用Microsoft Office Excel 2007整理，数据的统计分析均采用SPSS 20.0软件进行分析。抗旱性分析采用模糊数学中的隶属函数法，对抗性植株进行各种生理指标的综合评定，按照隶属函数加权值的高低评判抗旱性强弱。

若生理指标与抗旱性成正相关，隶属函数X=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）；若生理指标与抗旱性成负相关，隶属函数X=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）。

式中：Xi代表生理指标测定值；Xmin代表不同品种甘蔗各株系所对应生理指标的最小值；Xmax代表不同品种甘蔗各株系所对应生理指标的最大值。

2结果与分析

2.1EMS处理对幼胚愈伤组织分化率的影响

表1表明，随着EMS浓度的增加、诱变处理时间的加长，甘蔗愈伤组织分化率逐渐降低。诱变处理时间为8 h，EMS浓度为0.2%时，甘蔗愈伤组织相对分化率降为0，说明EMS处理时间对愈伤组织分化率影响很大。在EMS浓度为 0.2%～0.4%、处理时间为4 h，以及EMS浓度为0.4%、处理时间为2 h时，相对分化率为50%左右。

2.2选择剂PEG浓度的确定

由图1可见，未经EMS处理的黔糖5号分化苗在生根培养基中的生根率随着PEG浓度升高而降低，当PEG浓度为20 g/L时，生根率在85%左右；PEG浓度为60 g/L时，生根率降到50%；PEG浓度达到80 g/L时，生根率仅为14.6%，[JP3]甘蔗分化苗的根生长受到明显的抑制；当PEG浓度达到100 g/L时，[JP]

生根率降到10%以下，表明外植体几乎不耐受100 g/L PEG的干旱胁迫。因此，可采用100 g/L作为筛选抗旱突变体的PEG浓度。

2.3抗旱突变体的筛选

将经过EMS处理后的愈伤组织分化的504株分化苗接种到含100 g/L PEG的1/2MS生根培养基中筛选抗旱突变体，共得到生根的抗旱植株5株。在未经EMS处理的、仅为磷酸缓冲液处理的再生植株中，未获得抗旱植株。

2.4抗旱突变体株系的生理指标鉴定

将黔糖5号甘蔗5株抗性突变体植株移栽，命名为B1～B5，对其进行生理指标测定，以无处理的同期移栽再生苗为对照。

2.4.1干旱胁迫对抗性植株叶绿素荧光参数的影响

从图2可以看出，在未经干旱处理时，各植株最大光化学效率（Fv/Fm）均在0.83左右，且无显著差异。在干旱处理后，各植株的Fv/Fm均有下降，抗性植株下降幅度较小，下降幅度最大，其他株系仍维持高水平，显著高于，这表明诱变甘蔗具有一定的抗旱适应性。

2.4.2干旱胁迫对抗性植株相对电导率的影响

由于在水分胁迫条件下植物细胞膜会受到损伤，电导率大小可衡量伤害程度[11]。如图3所示，在没有停水干旱处理时，各植株相对电导率维持在正常水平，相互间无显著差异。干旱处理后，的相对电导率升至62.7%，抗性植株则显著较低，其中B5最低，仅为32.1%。这表明干旱胁迫下抗性植株的质膜受伤害程度比轻，说明诱变甘蔗具有一定的抗旱性。

2.4.3干旱胁迫对抗性植株MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生会加剧膜的损伤，因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性[11]。如图4所示，各参试株系的MDA含量在未停水干旱处理时均处于同一水平；干旱处理后MDA含量均大幅升高，尤其是、B3和B5，这3株涨幅最大，而B1、B2和B4则涨幅最小，显著小于其他株。表明干旱胁迫引起甘蔗叶片的膜脂过氧化作用，多数抗性植株能有效降低膜脂过氧化和膜系统的伤害程度，比对照更能适应干旱环境，具有一定耐旱性。

2.4.4干旱胁迫对抗性植株游离脯氨酸含量的影响

在干旱胁迫条件下，许多植物体内脯氨酸大量积累。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸[12]。如图5所示，各参试植株经过干旱胁迫处理后，游离脯氨酸的含量升高，B1、B2、B3、B5显著高于，B4与差异不显著。所有参试株系在未干旱处理前脯氨酸含量几乎在同一水平，无显著差异，说表明诱变甘蔗抗旱性有所提高。

2.4.5干旱胁迫对抗性植株叶绿素含量的影响

叶绿素含量的变化对光合作用产生直接影响，水分胁迫下叶绿素含量的变化可以指示植物对水分胁迫的敏感性，并直接影响光合产量。在控水未开始时，参试株的叶绿素含量无显著差异。干旱处理后，叶绿素含量下降，其中B1、B5的叶绿素含量显著高于（图6）。

2.4.6抗性植株抗旱性综合评价结果

为了全面反映甘蔗EMS诱变株经PEG胁迫后的抗旱性，采用模糊数学中的隶属函数法，对抗旱指标叶绿素荧光参数、相对电导率、MDA含量、脯氨酸含量、叶绿素含量等进行综合评价。隶属函数值即其加权值，加权值越大，表示耐旱性越好。如表2所示，B1、B2、B5抗旱性排在前3位，可见经EMS诱变和PEG筛选得到的植株有较强的耐旱性。

3结论与讨论

EMS因其诱变效率高、诱变范围广而在诱变育种中得到广泛使用，EMS不同浓度及不同处理时间对胚性愈伤组织的后效作用很明显。黔糖5号在0.2%～0.4% EMS下處理 2～4 h，胚性愈伤组织褐死率为50%左右，达半致死剂量。小麦花药愈伤组织用EMS溶液处理的较佳组合为0.2% EMS处理2～6 h，幼胚愈伤组织为（0.2%～0.4%）EMS处理24 h[13]。EMS处理猕猴桃胚性愈伤组织较佳组合为0.6% EMS处理2 h[14]。随着EMS浓度的升高和处理时间的延长，胚性愈伤组织褐死率呈上升趋势，增殖倍数和分化率呈下降趋势，这与前人的研究结果[15]相似。

试验利用半致死剂量EMS处理甘蔗愈伤组织，并在PEG胁迫压力下筛选出甘蔗抗旱突变体5株，并进行生理指标鉴定，以无处理的同期移栽再生苗为对照。抗性植株干旱处理下仍具有较高的光系统Ⅱ活性，脯氨酸、叶绿素含量维持高水平，相对电导率、MDA含量低于，表明诱变甘蔗在干旱环境下，受伤害程度比较小，耐旱性得到提高。

常规育种是最主要的育种手段，虽然选育到的变异多能稳定遗传，但育种周期长、进程慢，难以获得突变性变异。化学诱变突变率相对较高，能诱发出各种有用的突变基因，能够在原有遗传背景基本不变的情况下在分子水平上使植物出现有用性状的变异。但诱发突变的方向和性质尚难掌握，突变后有利个体往往不多。本试验得到了一些抗旱性增强的甘蔗株系，仅在实验室条件下得到验证，是否属于基因水平上的变异、能否在大田栽培中有稳定的表现，仍需进一步研究。

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