1种简单有效的根际土壤微生物DNA提取方法

郑道君 +张冬明 吉清妹 +史珍萍 符传良

摘要：研究了1种快速简便地提取高质量根际土壤DNA的改良十六烷基三甲基溴化铵（AB）法，应用该方法能简便快速地去除腐殖酸等干扰物质，从而获得高质量的根际土壤DNA。所得DNA的D260 nm/D230 nm值为1.477±0121，以此DNA为模板，可以获得带条清晰、重复性高的相关序列扩增多态性PCR（SRAP-PCR）扩增结果。

关键词：根际土壤；DNA提取；改良AB法；相关序列扩增多态性PCR（SRAP-PCR）

中图分类号： S154.34文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0039-02

通过传统分离方法获得并进行过研究的微生物种群数量只占自然界微生物总数的1%[1-2]，因此，采用培养的方法很难真实地反映土壤微生物的变化。近年来，不依赖于培养，直接从土壤中提取微生物总DNA进行分析的一系列分子生态学研究技术因其研究结果具有快速、准确、全面等特点，被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能及动态监测等方面的研究[3]。通过这些分子生态学技术，土壤不再是黑箱，而是可以看得见、摸得着的系统，使得许多年以来土壤微生物学家所面临的诸多问题可以得到解决。DNA的分离提取是分子生物学研究中重要的基本技术，从不同土壤中提取分离获得纯度较高的土壤DNA是进行土壤微生物分子生态学研究的前提。本研究探索了1种简单高效提取根际土壤DNA的改良十六烷基三甲基溴化铵（AB）法。

1材料与方法

1.1材料

土壤为取自海南省农业科学院农业环境与土壤研究所大棚的西瓜连作根际土壤，共连作3茬。每茬取样1次，作为1份样品。

1.2试剂与仪器

1.2.1主要试剂十六烷基三甲基溴化铵（AB）、三氯氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA），均为国产分析纯。100 bp DNA ladder、Taq DNA聚合酶、4×dNTPs mix，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司产品。相关序列扩增多态性（SRAP）引物序列为正向引物Me1（5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′）、反向引物Em4（5′-GAGCGTACGAATTTGA-3′），生工生物工程（上海）股份有限公司产品。

1.2.2主要仪器台式高速冷冻离心机；温水浴锅；制冰机；移液枪；紫外分光光度计；T100 Thermal Cycler型PCR仪（美国Bio-Rad）；水平电泳仪；凝胶成像系统等。

1.3试验方法

1.3.1取样及样品前处理（1）带土挖出整株植物的根系，挖出时尽可能多带些土；（2）轻轻抖去根系上大块的土壤，剪取约15 g的带土根系，置于装有灭菌的0.86% NaCl溶液的25 mL离心管中，并快速带回实验室；（3）将上述离心管放在冰中30 min，每隔5 min取出摇匀1次；（4）去掉植株根系，4 000 g、4 ℃低温离心30 min，然后去除上清液。将所得土壤沉淀物保存于-20 ℃备用。

1.3.2土壤总DNA的提取（1）取上述土壤样品约1.0 g于2.0 mL离心管中，置于液氮中3 min，再放入65 ℃水浴锅中解冻2 min，反复进行3次；然后在高通量组织研磨仪上用液氮研磨1 min，至粉未状。（2）立即将上述粉末转入65 ℃预热的800 μL 3×AB提取液[100 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.0），25 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl，2%硫基乙醇，3% AB]中，迅速混匀，置于65 ℃水浴约25 min，其间每隔 10 min 摇1次。（3）加入约等体积的三氯甲烷 ∶[KG-*3]异戊醇（24 ∶[KG-*3]1），90 ℃连续翻动至浑浊而无2相，15 000 r/min离心5 min，取上清。重复此操作2次。（4）取上清液加入5 μL 10 mg/mL RNase溶液，摇匀，室温下静置10 min。（5）加入无水乙醇至离心管满，此时马上看到白色絮状沉淀漂浮于上層乙醇中，切勿摇动。用灭菌牙签轻轻挑出白色絮状DNA沉淀。然后吸出下层提取液于另1支离心管中，吸至2相混合面颜色较淡的液体时，将此液体连同上层乙醇丢弃。（6）重复第（5）步3次，并将最后3次所得DNA沉淀转入同一离心管中，用70%乙醇清洗2次，晾干至DNA沉淀呈透明状，再溶于120 μL无菌ddH2O中，于4 ℃保存备用或长期保存于-20 ℃。

1.3.2DNA的质量检测用1.0%琼脂糖凝胶检测所提DNA的完整性；直接取100 μL用紫外分光光度计测定230、260、280 nm处的吸光度D230 nm、D230 nm、D230 nm，计算DNA的浓度，并估测DNA的纯度。

1.3.3SRAP扩增以上述提取的土壤总DNA为模板，进行SRAP-PCR扩增反应，以进一步检测所提DNA的质量，反应在iCyclerTM Thermal的Cycler型PCR仪上进行。采用李春楠等优化后的反应体系和扩增程序[4]。25 μL反应体系组成：2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，1.0 U Taq酶，0.4 μmol/L引物，30 ng DNA模板，用无菌超纯水补足至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 1 min，72 ℃ 120 s，5个循环；94 ℃ 45 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 120 s，35个循环；72 ℃ 10 min。反应重复1次。

PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶检测，以100 bp DNA ladder 作为对照分子量标准（marker），在0.5×TBE缓冲液中，于5 V/cm的条件下电泳，在Gel Doc XR型凝胶成像分析系统下照相并记录结果。

2结果与分析

2.1提取根际土壤DNA质量

由图1可见，琼脂糖凝胶电泳结果无拖尾现象，表明所提DNA基本上无断裂，完整性好。能够有效去除腐殖酸是土壤DNA提取的关键。腐殖酸在230 nm处有1个吸收峰，可通过估算D260 nm/D230 nm值来确定所提取的DNA中腐殖酸的污染程度，D260 nm/D230 nm值越高，表明DNA纯度越高；反之，表明腐殖酸污染越严重[5]。诸多学者报道土壤DNA提取法所获得的DNA D260 nm/D230 nm值在1.3左右[6-8]。本研究所获得的DNA D260 nm/D280 nm值在1.560～1.935之间，D260 nm/D230 nm值在

提取DNA的质量会影响PCR是否能扩增或扩增的效果。在提取土壤DNA时，影响DNA质量的主要是腐殖酸类物质，这类物质可以螯合Mg离子或与DNA或蛋白质发生共价结合，从而抑制酶的活性[9]。为了验证本方法所提取的DNA中是否含有杂质，采用SRAP扩增的方法来判断是否存在足以抑制Taq酶活性的抑制剂。由SRAP的扩增结果（图2）可见，本研究的DNA提取方法所提取的DNA完全可以用于SRAP-PCR反应，扩增条带清晰，结果重复性高。综上可见，本研究中所采用的DNA提取法是1种可以有效减少腐殖酸类物质的方法，用该法所提DNA几乎不含有酶抑制物等影响PCR反应的杂质。

2.2根际土壤DNA提取效率

经紫外-可见分光光度计检测，4份样品所提取的DNA浓度分别为0.062 8、0.103 2、0.056 9、0.049 5 μg/μL。经计算，用本方法所提取根际土壤DNA的产量为5.94～12.384 μg/g，这与张海燕等建立的方法获得的DNA产量[10]相当，较陈旭玉等建立的方法获得DNA产量[8]高。此外，本研究所建立的方法步骤简单，仅需6个步骤即可完成，需时1.0～1.5 h。可见本方法为操作简单、效率较高的土壤DNA提取方法。

3讨论

土壤微生物的种群和数量极易随着环境条件的变化而变化，因此为了确保所获得的研究结果能真实反映土壤微生物信息，在取样过程中既要迅速，又要砌底。可见取样过程是极为重要的，但也是常被研究者忽略的。为了正确与迅速取样，在本研究中，抖去根系大块土壤后直接将土壤置于装有灭菌的0.86% NaCl溶液的25 mL离心管中，并快速带回实验室进行样品预处理。根际土壤微生物在盐溶液中置于冰上 30 min，每隔5 min取出摇匀1次，这样既降低了土壤微生物的种群、数量的变化，减少在样品取样过程中的污染，同时也可使部分腐殖酸等杂质溶于0.86% NaCl溶液而得以去除。为了达到去除腐殖酸的目的，诸多学者对土壤样品进行了预处理，王澍等采用CaCO3溶液和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）磷酸溶液对样品进行预处理[11]；赵勇等在微生物细胞裂解前采用TENP缓冲液、磷酸盐缓冲液（PBS）对土壤样品进行了2次洗涤处理[7]；徐岩等采用2%磷酸缓冲液（pH值8.0，含2% PVP）对土壤样品洗涤处理用盐溶液低温振荡悬浮处理也有效去除了部分腐殖酸类物质。

在细胞裂解释放DNA时，不同的学者采用了2×AB提取液、溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸钠（SDS）裂解液对土壤样品进行处理。本研究则采用反复冻溶和3×AB提取液以使细胞壁充分裂解，并适当提高NaCl浓度（2.0 mol/L）以使DNA充分溶解，从而达到提高DNA产量的目的。在土壤DNA提取时，影响DNA质量的主要是腐殖酸类物质。这类物质主要通过影响PCR酶的活性致使PCR扩增失败。本法在沉淀DNA时，白色絮状DNA沉淀漂浮于上层无水乙醇中，快速挑出DNA沉淀，使之未与下层液体接触，因而能避免由于腐殖酸类物质等原因给DNA质量造成的影响。

目前所报道的土壤DNA提取方法中，为了获得更多的DNA沉淀，多数是用预冷的无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，并置于-20 ℃、30 min左右。这种方法虽然可以避免DNA断裂并可获得更多的DNA沉淀，但是低温可能会使AB溶液产生沉淀而影响后续工作。例如，导致DNA沉淀较难溶解和有AB残留，从而可能会对PCR产生影响。此外，长时间的沉淀会使更多的腐殖酸类物质随之沉淀而严重影响DNA质量。利用本方法所提取的DNA虽然浓度稍低，但可以有效去除腐殖酸等物质的干扰。同时本方法具有操作相对简单、整个过程所用时间短等优点，是1种简易快速获得高质量DNA的提取方法。[LL]

参考文献：

[1]Amann R I，Ludwig W，Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews，1995，59（1）：143-169.

[2]Ward D M，Weller R，Bateson M M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community[J]. Nature，1990，345（6270）：63-65.

[3]Pace N R. Amolecular viewofmicrobial diversity in the biosphere[J]. Science，1997，276：734-740.

[4]李春楠，崔海瑞，王伟博. 用SRAP标记研究根际土壤微生物的遗传多样性[J]. 生物多样性，2011，19（4）：485-493.

[5][JP2]顾华杰，李玉祥，赵明文，等. 几种水稻田土壤微生物总DNA提取方法的比较[J]. 江苏大学学报（医学版），2005，15（4）：300-305.[JP]

[6]徐岩，吴友根，张军锋，等. 广藿香根际土壤微生物总DNA提取方法的優化[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：45-47.

[7]赵勇，周志华，李武，等. 土壤微生物分子生态学研究中总DNA的提取[J]. 农业环境科学学报，2005，24（5）：854-860.

[8]陈旭玉，周亚奎，余贤美，等. 一种直接用于PCR的土壤微生物DNA提取方法[J]. 中国农学通报，2008，24（4）：33-36.

[9][JP2]李钧敏，金则新. 一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法[J]. 应用生态学报，2006，17（11）：2107-2111.[JP]

[10]张海燕，王彩虹，龚明福，等. 一种简单有效且适于土壤微生物多样性分析的DNA提取方法[J]. 生物技术通报，2009（8）：151-155.

[11]王澍，芮蕊，蔡婷，等. 不同无土栽培基质微生物DNA提取方法研究[J]. 西南林业大学学报，2012，32（4）：36-40.