铁皮石斛总RNA提取方法的比较研究

张志勇+阳静+齐泽民

摘要：针对铁皮石斛富含多糖、多酚等次生代谢物质的特点，以铁皮石斛叶片为材料，比较改良AB-LiCl法、SDS法以及试剂盒法提取总RNA的质量，利用电泳检测、核酸蛋白仪浓度测定、RT-PCR等进行验证分析。结果表明，3种方法均能提取铁皮石斛叶片中总RNA，但提取效果存在差异。改良AB-LiCl法提取总RNA的28S和18S条带清晰、D600 nm/D280 nm与D260 nm/D230 nm分别为1.96和2.03，RNA完整性好、纯度高，RNA浓度在3种方法中最高，达到560.6 mg/L，RT-PCR扩增出目的基因片段条带最明显，适用于后续的分子生物学研究。

关键词：铁皮石斛；总RNA；多糖；AB-LiCl法

中图分类号： Q522；S567.23+9.01文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0033-02

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属多年生草本植物，为2010年版《中华人民共和国药典》收载的名贵中药材品种。其干燥鳞茎入药，具有滋阴清热、益胃生津、增强免疫力、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等多种药理和保健作用，是石斛属中最为珍稀名贵的种，位列“中华九大仙草”之首[1-3]。对铁皮石斛的研究主要集中在化学成分[4]、药理和临床作用[1，5-6]、分类鉴定[7-8]、诱变育种[9-10]、组织培养及栽培技术[11-13]等方面。随着研究的深入，对铁皮石斛药用有效成分关键基因克隆和相关代谢调控网络的分子机理解析越来越受到研究者的重视。高质量RNA提取是基因克隆及其功能分析等分子生物学研究的前提，常用的RNA小量提取方法有SDS酚法[14]、异硫氰酸胍法[15]、AB法[16-18]等。铁皮石斛茎叶中富含多糖、酚类及生物碱等多种次生代谢产物[19]。尤其多糖多酚不易与RNA分离而共沉淀，影响RNA的质量，不利于后续分子生物学试验的开展。因此，本研究针对铁皮石斛多糖、多酚等次生代谢物质含量高的特点，通过比较改良AB-LiCl法、SDS法以及试剂盒法等3种方法提取的总RNA质量，建立1种简便高效的铁皮石斛总RNA提取方法，为铁皮石斛分子生物学研究中RNA高效获取提供一定的参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

供试铁皮石斛采自四川省高校特色农业资源研究与利用重点实验室大棚，为组培苗移栽后的2年生叶片，分别在相应部位剪取约1 g幼嫩叶片，液氮速冻后置于-80 ℃备用。

主要试剂：RNAiso Plus试剂盒（Takara公司），Reverse transcriptasM-MLV反转录试剂盒（Takara公司）；RNase固相清除剂（华越洋公司）；异硫氰酸胍；DEPC；AB；DL2000 Marker（Takara公司）；SDS、饱和Tris酚、三氯甲烷、β-巯基乙醇、无水乙醇、异戊醇、PVP等均为国产分析纯。

试验中所使用的塑料制品均在RNase固相清除剂为 1/1 000 的溶液中浸泡4 h，高温高压灭菌30 min，烘干备用；非塑料制品180 ℃烘烤8 h后使用。所有配制的提取溶液经0.1% DEPC水处理12 h以上，高压灭菌后使用。

1.2方法

1.2.1SDS法提取总RNA取铁皮石斛组培苗叶片在液氮中快速研磨至粉末状，加入80 ℃预热的SDS提取液，具体操作过程参考刘波等文献[14]提取百蕊草根系总RNA方法，获得的RNA沉淀自然干燥后加入30 μL 0.1% DEPC水溶解，-80 ℃保存备用。

1.2.2改良AB-LiCl法提取总RNA取铁皮石斛组培苗叶片在液氮中快速研磨至粉末状，在2 mL离心管中加入700 μL 65 ℃预热的AB提取液和60 μL β-巯基乙醇，剧烈振荡混匀后置65 ℃水浴10 min，其间摇动4～5次；加入等体积的酚 ∶[KG-*3]氯仿 ∶[KG-*3]异戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1），振荡混匀，冰浴 10 min；4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液至另一新的2 mL离心管，用等体积的酚 ∶[KG-*3]氯仿 ∶[KG-*3]异戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1）重复抽提1次；取上清液，加入1/2体积无水乙醇和1/3体积 10 mol/L LiCl，混匀后-20 ℃静置过夜；4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清；用DEPC处理的75%乙醇漂洗沉淀2次；4 ℃、10 000 r/min 离心5 min，弃上清，RNA沉淀自然干燥后用30 μL 0.1% DEPC处理水溶解沉淀，-80 ℃保存备用。

1.2.3RNAiso Plus试剂盒法提取总RNA将铁皮石斛叶片在液氮中快速研磨成粉末，使用宝生物（大连）有限公司的RNAiso Plus试剂盒，相关操作参照使用说明进行，提取的RNA沉淀用30 μL 0.1% DEPC水溶解，-80 ℃保存备用。

1.2.4总RNA质量检测3种方法提取的总RNA样品浓度和纯度均使用核酸蛋白仪检测，分别记录D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值及其浓度，并分别取2 μL RNA溶液在1.0%琼脂糖凝胶上以10 V/cm电泳15 min，检测RNA的完整性。

1.2.5RT-PCR检测分别以上述3种方法提取的总RNA为模板，使用Takara公司的PrimeScriptTM RT regeant Kit试剂盒，oligo dT primer和Random 6 mers為反转录引物，按说明书配制10 μL反应体系，37 ℃保温15 min反转录成cDNA，85 ℃ 下5 s使反转录酶失活。再以获得的cDNA为模板，根据已知的铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因序列（GenBank：KF711982.1）设计一对特异引物（上游引物：5′-TGATGGTCGTAGTCCGTAAT-3′，下游引物：5′-GGAACCCGTGCCAAACCAT-3′）进行RT-PCR扩增，目的片段大小179 bp。反应条件为94 ℃预变性4 min，（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）×30次，72 ℃ 5 min，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2结果与分析

2.1不同方法提取的总RNA质量比较

2.1.1RNA的完整性

经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测表明，3种方法提取的总RNA均有较整齐、清楚的28S、18S、5S条带，点样孔附近无明显亮斑，说明无蛋白质、糖类等杂质残留，但电泳结果存在较大差异（圖1）。其中SDS法提取的总RNA虽有3条完整条带，但RNA浓度较低，改良AB-LiCl法提取的总RNA条带清晰，亮度高、无明显拖带降解现象，其28S、18S条带与RNAiso Plus试剂盒法提取RNA的28S、18S条带亮度相当，这表明该方法提取的RNA完整性很好。

2.1.2浓度与纯度

D600 nm/D280 nm和D600 nm/D230 nm常用于分析提取的RNA纯度，高纯度的RNA溶液D600 nm/D280 nm应介于1.8～2.0之间，D600 nm/D230 nm应大于2.0[14]。由表1可见，SDS法提取的RNA D600 nm/D280 nm比值为1.83，但D600 nm/D230 nm 仅为1.62，说明可能有盐离子等杂质存在。改良 AB-LiCl法和RNAiso Plus试剂盒法提取的RNA D600 nm/D280 nm比值分别为1.96和2.02，D600 nm/D230 nm分别为2.03和1.92，表明所提RNA纯度高，蛋白质、酚类、糖类等杂质去除效果较好。改良AB-LiCl法和RNAiso Plus试剂盒法提取的RNA浓度均超过500 mg/L，远远大于SDS法的 97.4 mg/L。

2.2RT-PCR扩增结果

的目的片段，与预期结果相符。其中，改良AB-LiCl法扩增的条带亮度最高，SDS法条带亮度最弱，可见改良AB-LiCl法提取的总RNA产物能满足基因克隆、表达等后续分子生物学研究。

3讨论

获取纯度高、浓度大、完整性好的RNA是进行基因克隆、基因表达分析、转录组测序等分子生物学操作的前提[14，17，20]。近年来，有关植物RNA的提取方法有很多报道，但不同植物内含物组分及含量有很大差别，导致相关方法不能通用。铁皮石斛中富含多糖、多酚、生物碱等次生代谢产物，因多糖与RNA间的理化性质很相似，不易分开，在去除多糖的同时容易将大量RNA同时去除，影响后续试验。而多酚物质易氧化为醌，与RNA发生不可逆的结合，进行抽提时同样会带走部分RNA，因此，从富含多糖、多酚的铁皮石斛中提取高质量RNA的关键在于有效去除多糖和多酚等次生代谢物质[21]。

对于多糖物质的去除方法主要有高盐沉淀法、低浓度乙醇沉淀法、LiCl沉淀法、KAc沉淀法等[16]。本研究中，改良AB-LiCl法使用AB作为裂解提取液的效果优于SDS法。AB作为强变性剂，能够有效除去蛋白质等杂质，使用较高浓度的LiCl进行沉淀过夜，能有效去除多糖，同时提取液中加入的PVP也能和多糖结合，去除部分多糖。

RNA提取时去除酚类化合物主要包括加入强还原剂与加入络合物2种途径[16]。在提取缓冲液中加入的强还原剂有巯基乙醇、二硫苏糖醇或半胱氨酸等，其中巯基乙醇使用最广泛。本试验中改良AB-LiCl法使用的β-巯基乙醇的浓度提高至4%，同时，加入的络合物PVP有很强的结合多酚化合物的能力，可以减少酚类物质的影响。

参考文献：

[1]吕圭源，颜美秋，陈素红. 铁皮石斛功效相关药理作用研究进展[J]. 中国中药杂志，2013，38（4）：489-493.

[2]俞巧仙，郭英英，斯金平，等. 铁皮石斛多糖和醇溶性浸出物动态累计规律研究[J]. 中国中药杂志，2014，39（24）：4769-4772.

[3]张岗，李依民，李标，等. 铁皮石斛锌铁调控转运蛋白基因的克隆与表达分析[J]. 中国中药杂志，2015，40（1）：42-47.

[4]王换，张建霞，吴坤林，等. 不同石斛的生物学特性及主要成分比较研究[J]. 广东农业科学，2012（12）：44-46.

[5]何铁光，杨丽涛，李杨瑞，等. 铁皮石斛原球茎多糖DCPPla-1的理化性质及抗肿瘤活性[J]. 天然产物研究与开发，2008，19（4）：578-583.

[6]鲍素华，查学强，郝杰，等. 不同分子量铁皮石斛多糖体外抗氧化活性研究[J]. 食品科学，2009，30（21）：123-127.

[7]谢明璐，侯北伟，韩丽，等. 珍稀铁皮石斛SSR标记的开发及种质纯度鉴定[J]. 药学学报，2010，45（5）：667-672.

[8]卢家仕，卜朝阳，吕维莉，等. 不同产地石斛属种质资源的ISSR遗传多样性分析[J]. 中草药，2013，44（1）：96-100.

[9]詹忠根，徐程. 秋水仙素诱导铁皮石斛多倍体研究[J]. 浙江大学学报（理学版），2011，38（3）：321-325.

[10]张青华，李枝林，唐敏，等. 秋水仙碱诱导铁皮石斛多倍体研究初报[J]. 云南农业大学学报，2011，26（5）：678-682.

[11]孙志蓉，王美云，金家兴，等. 铁皮石斛试管苗生长发育动态研究[J]. 北京中医药大学学报，2010，33（2）：83-87.

[12]艾娟，严宁，胡虹，等. 温度对铁皮石斛生长及生理特性的影响[J]. 云南植物研究，2010，32（5）：420-426.

[13]常美花，金亚征，王莉. 铁皮石斛快繁技术体系研究[J]. 中草药，2012，43（7）：1412-1417.

[14]刘波，张晓明，郭巧生，等. 百蕊草根系总RNA提取方法比较及优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：44-46.

[15]卢河东，薛涛，李岳忠，等. 皖贝母总RNA提取方法的比较研究[J]. 中国中药杂志，2012，37（6）：781-784.

[16]王暑辉，徐倩，徐筱，等. 富含多糖多酚的侧柏叶片总RNA提取方法[J]. 吉林农业大学学报，2012，34（1）：76-80，89.

[17]李小婷，戴国礼，李彦龙，等. 沙棘叶片总RNA提取方法的比较研究[J]. 江苏农业科学，2014，42（3）：33-34.

[18]Nadiya F，Anjali N，Gangaprasad A，et al. High-quality RNA extraction from small cardamom tissues rich in polysaccharides and polyphenols[J]. Analytical Biochemistry，2015，485：25-27.

[19]He C M，Zhang J X，Liu X C，et al. Identification of genes involved in biosynthesis of mannan polysaccharides in Dendrobium officinale by RNA-seq analysis[J]. Plant Molecular Biology，2015，88（3）：219-231.

[20]张涛，韩梅，刘翠晶，等. 人参总RNA提取方法及反转录酶的比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（8）：34-37.

[21]容天聚，文国松，钱雄，等. 两种铁皮石斛总RNA提取方法的比较研究[J].