山东省渤海海洋保护区典型海域表层海水微生物群落多样性分析

付新华, 刘国宁, 何健龙, 马元庆, 宋秀凯, 孟 丽, 贾青妹



山东省渤海海洋保护区典型海域表层海水微生物群落多样性分析

付新华1, 刘国宁2, 何健龙3, 马元庆3, 宋秀凯3, 孟 丽1, 贾青妹1

(1. 潍坊医学院生物化学与分子生物学教研室, 山东潍坊261053; 2. 潍坊市海洋环境监测中心站, 山东潍坊261041; 3. 山东省海洋环境与资源研究院, 山东烟台 264006)

海洋微生物在生态系统循环中发挥重要作用。为系统了解山东省渤海海洋保护区表层海水微生物群落多样性, 作者利用Illumina高通量测序及生物信息学分析技术研究了12个水体样本的菌群构成和多样性特征。实验结果表明, 山东渤海海洋保护区典型海域表层海水微生物群落丰富, 12个水体样品OTU分属于25门、56纲、103目、163科、227属; 门、纲、目、科、属分类等级上的优势类群分别为变形菌门(Proteobacteria)(57.95%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)(21.88%)、黄杆菌目(Flavobacteriales) (4.31%)、红细菌Rhodobacteraceae)(10.68%)、(7.94%); 保护区内表层海水微生物具有其独特的菌群特征和多样性。本研究结果为进一步认识海洋微生物多样性与海洋生态环境保护的关系奠定了基础。

渤海海洋保护区; 微生物群落; 多样性分析

海洋微生物的种类繁多, 包括细菌、真菌、古细菌等, 物种数高达2亿~10亿[1], 它们在生态系统循环和生物活性物质开发中都发挥重要作用。因此, 海洋微生物研究已成为当今的一大热点, 并涉及环境、生态、医药等多个领域。王家生等[2]分析了海洋极端环境微生物活动与油气资源的关系; 余玥[3]研究了深海极端微生物正青霉(sp.)的化学成分。许多研究人员还从海洋微生物中分离得到多种糖类、肽类、甾醇类等具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌等作用的活性物质[4-6]。海洋微生物多样性研究对了解群落结构间的动态变化及其生态功能、修复海洋生态系统以及微生物资源的合理开发均具有重要意义。

Y市魔芋种植历史悠久，是魔芋产地、粗加工及魔芋精粉配送的中心位置，被誉为“魔芋之镇”。2014年，Y市还被中国魔芋协会评为全国九大“魔芋工业基地”之一，并且获得了“农产品地理标志”的称号。多年来，Y市当地农科院、加工企业与省市技术部门合作，开展了一系列有关魔芋的种植研究，包含魔芋高产新品种的选育、主要病害生态学及综合防治技术研究等，使得Y市魔芋种植技术处于领先地位，科技含量高。

传统的海洋微生物多样性研究方法如平板培养法、核酸分子RFLP、DGGE等方法, 极大地促进了海洋微生物生态学等相关学科的发展。但是这些方法仅能测定海水中的部分微生物种类, 而且灵敏度不够高。高通量测序, 如454 Life Sciences公司及Illumina公司的第二代测序技术以及其他的单分子测序技术等, 以同时对上万的基因位点进行分析为特色, 具有大规模平行测序、进行定量等优点, 越来越多地用于基因组分析, 涉及基因测序和基因组学研究等多个方面[7-8]。而Illumina测序技术又具有低错误率和低成本的优点, 使得简单、快速、较准确地获取海水微生物信息成为可能。16S rDNA是原核生物基因组中的高保守性和高特异性的DNA序列, 对其进行序列分析已成为检测和鉴定微生物的重要手段[9]。16S rDNA由保守区和高变区组成, 利用高变区可进行物种多样性分析[10]。对扩增后的16S rDNA高变区进行高通量测序避免了海洋微生物难纯培养等的困扰, 可使操作简单、分析全面而准确。

渤海为中国唯一内海, 资源丰富, 其中渔业、港口、石油、旅游和海盐是渤海的五大优势资源, 但是近封闭的内海特征使得其水体交换能力很差。作为黄河、辽河、海河三大水系的汇聚地, 环渤海区域在经济高速发展的同时, 其海区亦饱受污染事故的影响。海洋污染对海洋生物生存造成严重危害, 并影响了其生物多样性[11]。虽为中国重要海域, 但是对渤海海洋微生物资源研究较少, 且主要集中在海洋沉积物微生物上[12-14]; 而海水微生物则鲜有报道, 仅限于采用非高通量测序方法的研究[15-16]。是以保护海洋自然环境为目的, 依法对具有特殊保护价值的海域、海岸、河口、岛屿等划出一定面积予以特殊保护和管理的海洋相关区域。本研究采用Illumina Miseq 测序平台, 研究了山东省渤海海洋保护区典型海域表层海水微生物群落多样性, 本研究结果将对该海域生态系统的保护修复和微生物资源的开发利用提供基础数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况、海水样品采集与微生物收集

山东省渤海海洋保护区位于山东省渤海区境内, 是为保护贝类、鱼类等重点保护对象、有关部门在山东省渤海区海域设立的海洋保护区。作者于2014年秋季在保护区内选取了12个采样点, 采样点位置见图1, 取每个点的表层海水1 L, 封存后立即运往实验室供实验分析用。取样及封存方法根据中华人民共和国国家标准GB17378.3-2007。

水样先进行过滤以除去水体中的大颗粒, 再用0.22 μm微孔滤膜抽滤, 将滤膜有菌面对折后用无菌锡箔纸包住, 装于灭菌袋中, 标记好后置于–20℃保存。

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水体微生物DNA提取采用水样DNA提取试剂盒(OMEGA), 提取步骤参照说明书。提取后的微生物DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 凝胶成像系统分析DNA提取的结果, 符合实验需求的基因组–20℃保存备用。

分别用16sFF/16sFR、V3F/V3R和V4F/V4R 3对引物, 对水体微生物DNA的16S rDNA全长、V3高可变区、V4高可变区进行PCR扩增, 引物序列见表1。对纯化后质量合格的 PCR产物进行DNA文库的构建, 用合格的文库进行Illumina Paired-end测序。

表1 用于PCR反应的3对引物序列

1.3 数据处理与信息分析

高通量测序得到的原始数据滤除低质量的序列。使用FLASH软件[17]进行序列拼接, 利用重叠关系将成对读段(reads)拼装成高变区的序列标签(Tags)。利用USEARCH软件[18]将拼接好的Tags经过优化后, 在97%相似度下将其聚类为用于物种分类的操作单元(OTU)。通过OTU与数据库比对, 进行物种注释和OTU的物种分类。计算常用的α生物多样性指数: Chao、ACE、Simpson和Shannon指数, 分析微生物群落的多样性, 通过稀疏度分析样品的测序深度; 并采用QIIME 进行主成分分析(PCoA), 分析不同样品微生物多样性的差异[19]。

2 结果与分析

2.1 水体微生物16S rDNA全长、V3高变区、V4高变区扩增

12个海水微生物样本的总基因组DNA分别用3对引物扩增16S rDNA、V3高变区、V4高变区结果显示: 对于16S rDNA的扩增, 所得单一产物长度在1 000~2 000 bp, 条带清晰规则较亮, 即浓度较高; 对于V3高变区的扩增产物电泳条带近似弥散, 且条带较暗, 即浓度较低; 而对于V4高变区的扩增, 所得单一产物长度在250~500 bp, 条带清晰规则较亮, 即浓度较高。综上结果, 选取V4高变区进行高通量测序。

2.2 高通量测序原始数据处理

对山东省渤海海洋保护区12个水体微生物样本进行高通量测序, 共得到312 451条reads, 平均每个样品26 037条, SD值为209; 共拼装获得310 330条Tags, 平均每个样品25 860条, SD值为214; 共产生676个OUT。每个样品OTU统计结果见表2。

建筑施工行业是一个劳动密集型的产业，机械化水平较低，施工过程中需要依靠大量的工人参与手工作业，无法像工厂一样大规模生产出标准化的产品，不可避免地会产生一些缺陷或偏差。

表2 样品OTU统计

[7] 王兴春, 杨致荣, 王敏, 等. 高通量测序技术及其应用[J]. 中国生物工程杂志, 2012, 32(1): 109-114. Wang Xingchun, Yang Zhirong, Wang Min, et al. High-throughput sequencing technology and its application[J]. China Biotechnology, 2012, 32(1): 109-114.

通过与数据库进行比对, 对OTU进行物种分类, 并分别在门、纲、目、科、属5个分类等级水平上对各个样品作微生物物种构成柱状图。图2~图6显示了各样品在不同分类等级上的物种构成状况, 从图中可以直观看出不同物种在每个样品中所占的比例。门分类等级画所有物种的柱状图, 从纲分类等级开始, 将物种丰度在所有样品均低于0.5%的物种全部合并成其他(Others)。12个水体样品所有OTU分属于25门, 56纲, 103目, 163科, 227属。

2.3.1 门

总体上看, 12个水体样品内共有来自25个菌门的微生物种系型被鉴定出来, 微生物群落多样性样品间存在差异。在门水平, 水体内平均相对丰度处在前10位的微生物门类依次为变形菌门(Proteobacfteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、泉古菌(Crenarchaeota)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、厚壁菌门(Firmicutes)和脱铁杆菌门(Deferribacteres, SAR406); 平均相对丰度大于1%的有6种, 其中变形菌门(Proteobacteria)丰度高达57.95%, 拟杆菌门(Bacteroidetes)达15.79%, 蓝细菌门(Cyanobacteria)达11.27%, 放线菌门(Actinobacteria)达6.62%, 泉古菌门(Crenarchaeota)达 3.70%, 疣微菌门(Verrucomicrobia)达1.34%; 其他菌门平均丰度在1%以下。各样品在门分类等级上的微生物组成见图2。

2.3.2 纲

各样品在纲分类等级上的微生物组成见图3。12个水体样品中共检测到微生物56纲, 其中物种丰度在所有样品中平均高于0.5%的共有19个。平均相对丰度大于10%的纲分别是α-变形菌纲(Alphaproteobacteria) (21.88%)、g-变形菌纲(Gammaproteobacteria)(19.75%)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)(14.31%)和β-变形菌纲(Betaproteobacteria)(10.93%)。

2.3.3 目

②螺栓在下降的过程中，首扣出现了磕碰，造成了螺纹凸出螺纹表面，在旋入的过程中不断把螺牙上的材料带下来最终超过拧入的力矩保护值。咬死螺栓拆除后发现首扣螺纹有变形。

[10] 刘朝军. 16SrDNA 序列测定在细菌鉴定中的应用[J]. 军医进修学院学报, 2011, 32(7): 774-776. Liu Zhaojun. Application of 16SrDNA sequencing for identification of bacteria[J]. J Chinese PLA Postgrad Med Sch, 2011, 32(7): 774-776.

2.3.4 科

通过安装预应力波纹管（见图2），可以对孔道进行保护，防止预应力钢筋束在穿束过程中对混凝土结构造成损坏。固定塑料波纹管时，应先在箍筋上确定预应力曲线的具体的位置，然后通过钢筋马凳进行支托，间隔为700mm，然后通过焊接将支托的钢筋固定在箍筋上。为了保证塑料波纹管的施工的效果，避免在浇筑混凝土的过程中产生偏移，塑料波纹管和支托的钢筋的固定必须牢固。

12个水体样品中有微生物163科, 物种丰度在所有样品平均高于0.5%的共有32个。相对丰度最大的5个科所占比例总和达36.6%, 分别是红细菌科(Rhodobacteraceae)(10.68%); 嗜甲基菌科(Methylophilaceae) (9.50%); 盐单胞菌科(Halomonadaceae) (7.96%); 弯曲菌科(Campylobacteraceae)(4.31%)和OM60(4.15%)。各样品在科分类等级上的微生物组成见图5。

2.3.5 属

各样品在属分类等级上的微生物组成见图6。12个水体样品中含有微生物227属, 物种丰度在所有样品平均高于0.5%的共有22个。相对丰度最大的5个属所占比例总和达23.23%, 分别是(7.94%)、(4.72%)、弓(形)杆菌属()(4.31%)、亚硝化侏儒菌属() (3.69%)和海洋生菌属()(2.57%)。

[9] Kolbert C P, Persing D H. Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens [J]. Curr Opin Microbiol, 1999, 2(3): 299-305.

选择底物质量浓度、酶添加量、酶解温度、酶解时间作为考查因素。底物质量浓度设置为10，20，30，40，50，60 mg/mL；酶添加量设置为 0.5×105，1×105，2×105，8×105，14×105，20×105U/mg；酶解温度设置为40，45，50，55，60，65℃；酶解时间设置为1，2，3，4，5，6 h。每个设计做3个平行样取其平均值进行计算分析。

样品的a多样性分析见表3, 12个水体样品chao平均值为410.68, ace平均值为417.67, shannon平均值为4.30, simpson平均值为0.0313, 样品微生物多样性较高。

对教师A的反思日志总结后，主要内容有：学生专业特点、学生课堂表现、师生互动、教案中的课堂设计、教学方法、师生关系、对传统课堂的反思。其中对学生专业特点和学生课堂参与度反思较多。

裂缝宽度也称裂缝开度，开度决定了裂缝的规模，同时开度是裂缝物性参数计算中的关键参数，因此对裂缝开度的定性研究成为储层裂缝的重要研究内容。以肉眼能否识别为依据，裂缝的规模可简单分为大裂缝和微裂缝两种类型。一般大裂缝反映形成时期的构造应力场较强，微裂缝则相反，反映形成时期的构造应力场较弱［1］。本次研究主要通过野外露头、岩心观察对大裂缝进行定量描述，通过薄片观察对微裂缝进行研究。

稀疏曲线用来评估所测序列库容中环境微生物的种类和数量。样品稀疏曲线显示12条曲线已达到平台期, 表明通过高通量测序技术, 12个水体样品中的微生物基本完全测出(图7)。

[15] Zhang Jiaojiao, Ma Guannan, Deng Yuangao, et al. Bacterial diversity in Bohai Bay solar saltworks, China[J]. Current Microbiol, 2016, 72(1): 55-63.

3 讨论

本研究利用Illumina Miseq测序平台对山东省渤海海洋保护区典型海域表层海水微生物群落特征和多样性进行了初步研究, 列出了保护区海水微生物门、纲、目、科、属不同分类等级上的优势群落类型和相对丰度。虽然本次研究所采集海水样本的数量及其分布范围有限, 但是Illumina Miseq高通量测序技术的应用为进一步对山东省渤海海洋保护区内海水微生物资源的调查积累了一定的经验和新的技术支撑。本研究中, 12个样品在遗传距离0.03下的稀疏曲线已达到平台期, 说明通过高通量测序技术测出的微生物包含了山东省渤海海洋保护区内水体样品中微生物的绝大部分。微生物群落特征显示, 山东省渤海海洋保护区表层海水内存在大量微生物群落, 并具有其独特的菌群特征和多样性。保护区内表层海水微生物在门、纲、目、科、属不同分类等级上的未分类OUT分别为0.40%、1.08%、11.89%、23.53%, 62.81%, 说明随着分类的细化无明确分类名称信息的群落类型所占比例增大, 这可能与测序区间、序列长度以及比对的数据库等有关。

表3 样品Alpha多样性统计结果

本研究在山东省渤海海洋保护区典型海域表层海水中共检测出变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)等25门, 其中变形菌门是相对丰度最高的微生物类群, 这一结果与国内外关于水体微生物多样性的很多研究相一致[20-22]。对黄海表层海水微生物多样性的研究报道显示, 其水体微生物群落主要有变形菌门、拟杆菌门、蓝细菌门、疣微菌门、放线菌门和浮霉菌门[23]。渤海与黄海表层海水微生物组成在门分类等级水平上有较高的相似性, 这可能与两者地理位置相近有关。微生物类群的相对丰度与其多样性有关, 研究中按97%相似性定义OTU是因为微生物群落并不仅仅是只含有少数高相对丰度的基因型, 而是含有大量相对独特的基因型。

Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析[24], 包括observed species指数、chao指数、ace指数, shannon指数以及simpson指数等。前面4个指数越大, 最后一个指数越小, 说明样品中的物种越丰富。本研究中12个样品chao平均值为410.68, ace平均值为417.67, shannon平均值为4.30, simpson平均值为0.0313, 表明渤海海洋保护区内微生物多样性较高。主坐标分析(PCoA)可以展示样品间微生物多样性的差异大小, 如果两个样品距离较近, 则表示这两个样品的物种组成较相似。主坐标分析图中的一个点代表一个样品, 两个点之间的距离越近, 说明两个样品的微生物群落差异越小。本研究中12个取样点, 除两个取样点外的其他取样点水体微生物样品不能聚集在一起, 说明渤海海洋保护区不同区域间微生物组成差异显著。

水体污染会影响其微生物群落组成与多样性[24-25]。渤海为中国内海, 山东省渤海海洋保护区距离陆地较近, 海洋微生物会由于海水的有机物污染而获得大量营养物质, 人类活动会影响微生物的群落组成及其多样性。对渤海海水微生物多样性的研究不仅有利于对其微生物群落结构的了解, 而且有助于特殊功能微生物的发现和开发。另外, 海水温度、溶解氧和季节可能是影响渤海水体微生物群落结构特征的重要因素。有研究表明, 海洋中微生物的组成及其多样性与海水的温度、季节、深度等环境条件相关[26-28]。2008年发生在黄海的浒苔灾害曾引起表层海水中a-变形菌和蓝细菌的增加,g-变形菌纲和拟杆菌的减少[23]。因此, 有关温度、溶解氧含量、浮游生物和季节等因素对渤海表层海水微生物分布和其群落结构变化的影响, 有待深入研究。

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(3) 动物园的安全警示是否充足。根据城市动物园管理规定第三章第二十一条：动物园管理机构应当完善各项安全设施，加强安全管理，确保游人、管理人员和动物的安全。动物园方应该设置足够多且位于醒目位置的警示牌、在危险区域安排足够多的巡逻车、安装数量充足的监控摄像头保证二十四小时的不停歇监控, 在发现游客有危险举动时应立即上前劝阻与阻拦。

2.相关政策章程的颁布及试点工作方案的细化，为试点工作制定了基本规范。2017年5月17日，财政部《关于在粮食主产省开展农业大灾保险试点的通知》发布以来，各地、各粮食主产省、各试点县更为具体的试点方案细则纷纷出台。其中，粮食大省山东于2017年6月24日率先出台了《山东省农业大灾保险试点工作方案》。相关政策细则相继颁布，各地因地制宜地推出的地方性、区域性、个性化、特色化的农业大灾保险试点工作方案，使农业大灾保险的发展有章可循。

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2.3 水体微生物群落结构

1.2 微生物DNA提取、扩增和高通量测序

(1)通过钻探、测井、二维地震三种勘探手段对比分析，查明了QN-06V井目的煤层(3号)缺失的原因为构造(F4正断层)断失。

2.4 水体微生物多样性指数

各样品在目分类等级上的微生物组成见图4。12个水体样品中包含微生物103目, 其中物种丰度在所有样品平均高于0.5%的共有30个。相对丰度大于5%的目分别是黄杆菌目(Flavobacteriales)(14.31%)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)(10.07%)、嗜甲基菌目(Methylophilales)(9.50%)和交替单胞菌目(Alteromonadales)(7.39%)

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使用主坐标分析(PCoA)的方法展示12个水体样品间微生物多样性的差异大小。主成分PC1和次要成分PC2分析结果见图8。由图可见多数样品点之间距离较远, 表明组间差异显著。主成分分析结果显示, PC1贡献度为49.45%, PC2贡献度为20.09%, 除5号和6号取样点外的其他取样点水体微生物样品不能聚集在一起, 说明样品间水体微生物组成有差异。

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道路交通水泥路面混凝土质量是行业发展竞争的关键，在施工中应该思考科学有效的施工质量管理理论与方法，将技术内容付诸于管理与施工切实行为中实现，为公路建设建立基于全面质量管理的完善化质量保证体系。

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Analysis ofmicrobial communitydiversity in the Bohai Sea marine protected areas of the Shandong Province

FU Xin-hua1, LIU Guo-ning2, HE Jian-long3, MA Yuan-qing3, SONG Xiu-kai3, MENG Li1, JIA Qing-mei1

(1. Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 2. Weifang Marine Environment Monitoring Centre, Weifang 261041, China; 3. Shandong Marine Resource and Enviroment Research Institute, Weifang 264006, China)

Marine microbes play an essential role in marine ecosystems. To systematically understand microbial community diversity in the Bohai Sea marine protected areas of the Shandong Province, we investigated the microbial community composition and diversity of 12 water samples using the Illumina high-throughput sequencing and bioinformatics analysis technology. Results for the 12 sampling points showed that the number of relative microbial groups included 25 phyla, 56 classes, 103 orders, 163 families, and 227 genera. Dominant groups at the phylum, class, order, family and genus classification levels were Proteobacteria (57.95%), Alphaproteobacteria (21.88%), Flavobacteriales (14.31%), Rhodobacteraceae (10.68%), and(7.94%), respectively. These findings suggest that Bohai Sea marine protected areas in the Shandong Province brine have high levels of microbial diversity. This diversity provides basic information and knowledge to further understand the relationship between marinemicrobial diversity andprotection ofoceanic environmentecology.

Bohai Sea marine protected areas; microbial community; diversity analysis

X55

A

1000-3096(2017)01-0039-09

10.11759//hykx20160329002

2016-03-29;

2016-04-27

山东省渤海海洋生态修复及能力建设项目(20140601); 山东省高等学校科技计划项目(7J12LE51); 山东省科技发展计划项目(2014GSF117030); 潍坊市科学技术发展计划(2016ZJ1047)

付新华(1976-), 女, 山东茌平人, 副教授, 博士, 主要从事生物化学与分子生物学研究, 电话: 0536-8462531, E-mail: wfyxyfxh@163.com

Mar. 29, 2016

[Ecological Restoration and Capacity Building Program for Bohai Sea of Shandong Province, No.20140601; The Project of Shandong Province Higher Educational Science and Technology Program , No.7J12LE51; Science and Technology Development Projects of Shandong Province, No.2014GSF117030; Weifang Science and Technology Development Plan, No.2016ZJ1047]

(本文编辑: 谭雪静)