绿潮藻浒苔微生物高效降解及生物乙醇制备

王淑贤, 韦章良, 贾 睿, 张建恒, 霍元子, 于克锋, 何培民



绿潮藻浒苔微生物高效降解及生物乙醇制备

王淑贤1, 2, 韦章良3, 贾 睿1, 2, 张建恒4, 霍元子1, 2, 于克锋1, 2, 何培民1, 2

(1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 2. 上海海洋大学水域环境生态上海高校工程研究中心, 上海 201306; 3. 中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东广州510301; 4. 上海海洋大学海洋科学学院, 上海 201306)

从绿潮藻暴发海域的底泥和腐烂浒苔()中, 筛选出一株可高效降解浒苔纤维素的微生物菌株(F菌株), 通过刚果红染色实验以及真菌的ITS分析, 鉴定为曲霉属真菌。以浒苔为诱导培养基制备F菌株的粗酶液, 测得其滤纸纤维素酶活为34.79 U/mL。在发酵实验中, 当酶解条件为6%的粗酶液添加量、反应温度为38℃、反应时间为60 h、pH为6.8时, 浒苔纤维素降解效果最好, 酶解液发酵乙醇产量最高达到28.98 g/L。

浒苔(); 纤维素降解菌; 发酵; 生物乙醇

随着可利用化石燃料的逐渐减少以及化石燃料燃烧时所带来的环境问题, 探索可再生、清洁无污染的绿色能源已越来越受到世界人们的广泛关注[1]。目前研究的可再生清洁燃料主要有生物柴油、生物乙醇、生物丁醇以及生物沼气等[2]。美国从2007年开始启动了多项生物燃料工程项目, 带动了藻类生物燃料开发热潮[3]。然而以海洋藻类生物质开发生物能源在国内的研究还比较少。温顺华[4]、蒋媛媛[5]分别对马尾藻和铜藻制备生物乙醇有过实验探究, 但乙醇产量均不高, 仅为9.2%和7.8%。

第一代燃料乙醇由于使用玉米、大豆等经济作物导致粮食价格上涨而被迫放弃[6]; 第二代燃料乙醇由于木质素处理难题, 一直止步不前; 而以海洋藻类生物质为原料的第三代燃料乙醇[7], 因其生长周期短、生长速率快、不含木质素且生物量巨大[8]而受到广大研究学者的关注。

自2007年起, 我国已连续8年暴发绿潮自然灾害。2008年, 仅青岛海域打捞起的绿潮藻浒苔()就近120万t[9]; 福建沿海每年的绿潮暴发量多于10万t[10], 专家认为黄海绿潮每年的总暴发量在千万吨以上[11]。绿潮的暴发, 除了引起鱼虾死亡和水质恶化外, 更大的问题在于其巨大的生物量难以处理, 无处填埋[12], 并且打捞起的浒苔短时间内就会腐烂发臭, 带来严重的环境问题。浒苔中纤维素和半纤维素的质量分数达到33.7%[13], 使其成为很好的第三代燃料乙醇的生产原料。目前, 国内对藻类纤维素的处理方法主要有物理法[14]和化学法[15]以及生物酶法[16]。物理法和化学法处理藻类纤维素对设备要求高, 反应不易控制, 并且处理后的产物容易造成环境污染。因此, 如何正确处置每年暴发的大量绿潮藻浒苔和有效降低藻类生物质发酵乙醇的生产成本已成为我国海洋科学领域的重要研究内容。本研究将化石燃料的短缺现状与我国暴发绿潮藻巨大生物量处理问题相结合, 以绿潮藻浒苔为发酵原料, 利用实验室筛选到的产纤维素酶菌株进行酶法降解浒苔, 为探究第三代燃料乙醇的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 藻粉

浒苔藻样采自2014年5月江苏省大丰市沿海漂浮浒苔。将采回的新鲜浒苔, 用干净海水冲洗3遍, 去除泥沙、杂质及其他杂藻, 烘干粉碎后, 过80目筛, 自封袋保存于阴凉处备用。

1.2 培养基

选择培养基: 纤维素粉8.0 g, NaNO31.0 g, KCl 0.5 g, Na2HPO41.2 g, KH2PO41.0 g, MgSO40.5 g, 酵母粉0.5 g, 水解酪蛋白 0.5 g, 蒸馏水1 000 mL, 琼脂粉18.0 g, 自然pH。

鉴别培养基: 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5.0 g, 酵母膏1.0 g, KH2PO40.25 g, 土豆汁100 mL, 琼脂粉18.0 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然pH。

浒苔纤维素诱导培养基(细菌): 浒苔粉8.0 g, 蛋白胨2.0 g, 酵母粉5.0 g, NaCl 5.0 g, 蒸馏水1 000 mL,自然pH。

浒苔纤维素诱导培养基(真菌): 浒苔粉6.0 g, 葡萄糖4.0 g, 蛋白胨2.0 g, MgSO4·7H2O 5.0 g, KH2PO40.5 g, 1%孟加拉红水3.3 mL, 3%氯霉素液3.0 mL, 蒸馏水1 000 mL, 自然pH。

酵母菌活化培养基: 酵母粉 10 g, 蛋白胨 20 g, 葡萄糖 20 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然pH。

发酵培养基: 浒苔粉200 g, 2%硫酸1 000 mL, 120℃处理60 min, 调pH中性。

除发酵培养基外, 上述培养基均1×105Pa灭菌30 min后使用, 为防止糊化, 酵母菌活化培养基115℃灭菌15 min。

1.3 纤维素分解菌株的筛选与鉴定

1.3.1 纤维素分解菌的初筛

在浒苔漂浮的海域和腐烂浒苔的底泥中, 分别采样带回实验室, 同时从采回的新鲜浒苔中, 称取20 g湿浒苔于500 mL烧杯中, 加入200 mL自然海水, 用纱布封口, 28℃条件下自然腐烂10 d[17]。

1.3.2 纤维素分解菌的分离与鉴定

将腐烂的浒苔底泥和样品液进行梯度稀释, 取稀释至10–6样品液150mL涂布于选择培养基平板中, 置于恒温培养箱30℃培养3 d, 挑取能够在选择培养基中生长的单菌落划线分离, 转接到鉴定培养基平板上。

刚果红染色初步鉴定: 在长出菌落的鉴定培养基中, 通过刚果红染色实验[18]后水解圈的大小, 初步鉴定具有纤维素分解能力的菌株, 并挑出单菌落划线分离, 纯培养。

细菌的16s rDNA鉴定: 筛选到的菌株纯化后, 用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒SK8255提取菌株的总DNA。使用通用引物7F: 5′-CAGAG TTTGATCCTGGCT-3′和1540R: 5′-AGGAGGTGATC CAGCCGCA-3′进行PCR。PCR反应体系为: Template (基因组DNA20~50 ng/mL) 0.5mL, 5×Bufffer 2.5mL, dNTP 1mL, 酶0.2mL, 引物各0.5mL, 加双蒸水至25mL。PCR循环条件: 98℃预变性30 min, 98℃ 25 s, 55℃ 25 s, 72℃ 1 min, 30个循环, 后72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 回收后与pMD18-T载体链接, 挑选阳性克隆质粒, 酶切后送上海生工公司测序, 将测序结果用NCBI的Blast程序进行序列同源性比对。

真菌的ITS鉴定: 筛选到的菌株纯化后, 按上海生工公司提供的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒SK8259提取菌株的总DNA。使用菌种鉴定通用引物, NS1: 5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和NS6: 5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′, 由上海生工公司合成。PCR反应体系为: Template(基因组DNA20~50 ng/mL) 0.5mL, 10×Bufffer 2.5mL, dNTP 1mL, 酶0.2mL, 引物各0.5mL, 加双蒸水至25mL。PCR循环条件: 94℃预变性4 min, 94℃ 45s, 55℃ 45 s, 72℃ 1 min, 30个循环, 后72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 回收后与pMD18-T载体链接, 挑选阳性克隆质粒, 酶切后送上海生工公司测序, 将测序结果用NCBI的Blast程序进行序列同源性比对。

1.4 粗酶液的提取

选取1.3.2中筛选到的菌株, 制取粗酶液。

粗酶液1: 常用基础LB培养基和马丁培养基, 培养5 d, 转速为170 r/min, 温度为28 ℃。5 d后, 取出菌液, 6 000 r/min离心8 min, 上清液为粗酶液。

粗酶液2: 用浒苔纤维素诱导培养基, 培养5 d,转速为170 r/min, 温度为28℃。5 d后, 取出菌液, 6 000 r/min离心8 min, 上清液为粗酶液。

1.5 菌株纤维素酶活性检测

取1.4中得到的粗酶液, 稀释10倍后, 按照文献[19]对筛选到的产酶菌株进行滤纸纤维素酶活检测。酶活定义在37℃, pH5.5, 反应时间为60 min的条件下, 每分钟降解滤纸释放1mmol葡萄糖所需的酶量, 定义为一个滤纸纤维素酶活单位, 以U表示。实验中滤纸纤维素酶活以表示, 单位为酶活性单位(U/mL),按下式计算:

=(/×)×1000×(1)

式(1)中

——实验中纤维素酶的活性, 单位为酶活性单位(U/mL);

——根据标准曲线上对应的葡萄糖的质量, 单位为毫克(mg);

——葡萄糖的摩尔质量, 180.2 g/mol;

——酶解反应时间, 单位为min;

1 000——转化因子, 1 mmol=1 000mmol;

——实验的总稀释倍数。

1.6 菌株纤维素酶降解浒苔发酵效果探究

选取实验中筛选到的产酶活性高的菌株, 制备粗酶液, 通过粗酶液添加量, 反应温度, 反应时间和反应pH4方面分别探究浒苔制备乙醇的最佳效果(表1)。其中, 发酵五碳糖的酵母菌32868和发酵六碳糖的酵母菌1043, 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供, 活化后, 各加入5%的酵母菌种子液进行发酵, 无菌取样, 测定乙醇浓度, 同时按DNS法对发酵液中的还原糖进行检测, 每组3个平行。

表1 不同条件下浒苔发酵实验

1.7 乙醇浓度的测定

乙醇浓度检测使用SBA-40E生物传感分析仪测定。乙醇标准液配制: 50mL无水乙醇溶于100 mL蒸馏水中, 现配现用。

2 结果

2.1 纤维素分解菌的筛选结果

通过选择培养基初筛和刚果红染色实验初步鉴定,共筛选到2株产纤维素酶菌株, 分别是浒苔漂浮海域中筛选到的菌株(H菌)和实验室条件下腐烂浒苔中筛选到的菌株(F菌), H菌透明水解圈平均直径为1.0 cm±0.2 cm, F菌透明水解圈平均直径1.3 cm± 0.2 cm。从微生物形态学上观察, H菌株为细菌, F菌株为真菌。如图1所示。

2.2 分子鉴定结果

PCR扩增产物得到的蛋白质电泳图如下(图2), H菌株PCR扩增产物得到的目的片段长度约为1.5kb左右, 与16SrDNA序列长度一致。将得到的产物克隆后测序, 得到1431 bp长度的序列, 与GenBank 库中已有的细菌16S rDNA 序列Blast比对后, 发现其与芽孢杆菌属同源度高达99%。F菌株PCR产物经克隆后测序得到1308 bp, 其在GenBank中的比对结果与曲霉属真菌()高度相似, 选取最相近的10个序列, 用mega4.1构建系统进化树, 如图3所示系统进化树, 其与(AB00841.1)最为接近。该序列在GenBank的登录号为: KX272754。根据形态学和分子系统学鉴定, 初步得到F菌株为曲霉属真菌。

M: DNA Marker; 1: H菌株PCR产物; 2: F菌株PCR产物

M: DNA marker; 1: strain H PCR product; 2: strain F PCR product

2.3 菌株纤维素酶活检测结果

滤纸法纤维素酶活检测实验中, 得到的葡萄糖标准曲线为= 0.846–0.028,2= 0.999。H菌株和F菌株的两种粗酶液酶活如(图4)所示。浒苔纤维素诱导培养基制取的粗酶液, 即H2和F2酶活分别高于H1和F1酶活; 同一培养基所得到的粗酶液中, F菌株又高于H菌株, F菌株最高酶活达到34.79 U/mL。这与刚果红染色实验中水解圈大小的结果是一致的。F菌株现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心, 保藏号: CGMCC NO.11767。

2.4 不同条件下浒苔发酵实验结果

纤维素酶活实验证明F菌株的产酶能力较强, 因此在浒苔发酵实验中选用F菌株粗酶液对浒苔降解发酵, 从图5A中可以看到, 对照组中没有添加粗酶液, 仍检测到乙醇, 但乙醇含量非常低。随着粗酶的增加, 还原糖含量增加, 同时乙醇产量也上升。当粗酶液的添加量达到6%时, 还原糖含量不再增加, 但是乙醇产量继续升高。由实验结果(图5 B)可知, 在温度低于38℃时, 随着温度的升高, 乙醇产量逐步上升。当温度达到38℃时, 乙醇产量达到最高, 为28.98 g/L, 后温度继续升高, 乙醇产量反而下降。在发酵时间达到60 h时(图5 C), 乙醇产量不再随着酶解时间的增加而提高, 发酵后期, 乙醇浓度不再变化, 还原糖含量仍在继续下降, 但下降并不剧烈。pH为6.8时, 乙醇产量达到最高, 但还原糖浓度并不升高(图5 D)。

3 讨论

海洋藻类作为第三代燃料乙醇的生产原料, 具有非常强大的市场潜力[20], 但是藻体中存在的纤维素、半纤维素是阻碍藻类生物质进行规模化发酵生产乙醇的瓶颈。纤维素是D-葡萄糖以β-1, 4糖苷键为基环组成的大分子多糖[21], 通常与半纤维、木质素形成结构复杂稳定的大分子物质[22]。自然界中产纤维素酶微生物包括真菌, 细菌和放线菌。不同微生物所产纤维素酶的结构和功能也相差很大, 纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶(1, 4-β-D-glucan glucanohydrolase)、外切葡聚糖酶(1, 4-β-D-glucan cellobilhydrolase)和β-葡聚糖苷酶(β-1, 4- glucosidase)。大多数的细菌和放线菌产酶能力较低, 所产酶多数都是胞内酶, 很难分泌到细胞外对纤维素的降解起作用。20世纪90年代末, 学者们发现曲霉属真菌产生的多为胞外酶, 并且产酶能力也高于细菌和放线菌[23]。本研究从自然界中筛选到的F菌株是曲霉属的一种, 根据水解圈的大小, 可以初步判断出F菌分解纤维素的能力比H菌稍强, 在酶活检测的实验中, F菌株最高酶活达到34.79 U/mL, 也验证了这一点。用F菌株所产纤维素酶进行浒苔的降解发酵, 一方面避免了因产胞内酶而降低降解效果; 另一方面, 由于F菌株所产纤维素酶为胞外酶, 所以粗酶液的制备用过滤、离心等简单方法就可以获得, 操作简便。与此同时, 传统的物理法和化学法在降解纤维素过程中会形成大量的副产物, 对后续的发酵也有很强的抑制作用, 使乙醇发酵产率偏低, 并伴有环境污染, 而使用菌株所产纤维素酶降解浒苔, 不仅降低了对反应设备的要求, 而且反应温和, 对环境无污染, 同时不形成副产物, 可避免乙醇产率偏低等问题。

本研究中用筛选到的F菌自产纤维素酶对浒苔进行降解, 并优化了其酶解液发酵乙醇的最佳条件, 使乙醇最高产量达到28.98 g/L, 比刘正坤[24]实验中的乙醇产量(13.2 g/L)高15.78 g/L。Song-Mok Lee[25]等在用微生物同步糖化发酵海带的研究中指出, 乙醇最高产量为2.59 g/L, 其研究中乙醇产量偏低的原因在于微生物所产酶为胞内酶, 因此降解效果不明显, 导致乙醇产量较低。而本实验中的F菌株属曲霉属真菌, 其所产纤维素酶可经低温离心快速获得, 保证了酶的活性, 能够高效率降解纤维素, 获得较高含量的还原糖类, 因此在后续的发酵试验中, 酵母菌可利用的还原性糖含量较高, 发酵产物乙醇产量也继而提高。本实验中乙醇产量高于其他研究结果的另一个原因在于, 实验中用稀酸前处理浒苔, 即用2%的硫酸120℃、1h处理后再进行粗酶液降解, 稀酸和高温对纤维素本身结构就有一定的破坏, 之后再使用粗酶液进行降解, 使得降解效果比单一直接使用粗酶液效果更好, 因此, 乙醇的最高产量可达28.98 g/L。

海洋藻类生物质产量巨大, 以海洋藻类生物质为原料发酵生产乙醇是未来能源探索的有效途径[26]。但是从藻类转变生物乙醇的过程, 还存在一系列尚待完善的地方, 仅仅依赖筛选自然界中的野生型菌株产酶进行海洋藻类生物质的降解还远远不够。美国藻醇(Algenol)公司利用蓝藻光合产物在细胞内直接转化产出乙醇已进入室外产业化论证阶段[27]。根据这项研究结果, 未来在大型绿藻浒苔的发酵研究中, 同样可以通过开发产酶活性高的基因工程菌进行浒苔纤维素的高效降解, 同时选择高效发酵菌种以及优化发酵工艺流程, 可更大程度地提高发酵产量, 使藻类资源得到更充分的利用。

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Screening and characterization of a newly isolated strain for microbiological degradation ofand bioethanol production

WANG Shu-xian1, 2, WEI Zhang-liang3, JIA Rui1, 2, ZHANG Jian-heng4, HUO Yuan-zi1, 2, YU Ke-feng1, 2, HE Pei-min1, 2

(1. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Water Environment and Ecology Engineering Center of Shanghai Institute of Higher Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 4. College of Marine Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

has been the dominant species in the huge annual biomass accumulation during green algae bloom in Yellow Sea since 2007. This species can be used for energy utilization by fermentation under certain conditions. In this study, we identified ahighlyefficient cellulose-decomposing microorganismbyscreeningthe rotten algae and employedit as a raw material to manufacture bioethanol. We studied its cellulose activity and the ability to decomposeatdifferentreaction temperatures, times.pH, and dosages of crude enzyme. We identified the strain with highest efficiency in cellulose-decomposition using Congo red staining method and ITSand termed it as theF strain (34.79U/mL). We also foundthatthe optimum conditionsfor the fermentation ofwere as follows: crude enzyme, 6%; treating temperature, 38°C; treating time, 60 h; and pH, 6.8. Under these optimum conditionsbioethanol yield of up to 28.98g/Lwas achieved.

; cellulose-decomposing microorganisms; fermentation; bioethanol

P745

A

1000-3096(2017)01-0076-07

10.11759/hykx20160423003

2016-04-23;

2016-06-29

国家自然科学基金(41576163); 国家重点研发计划项目(2016YFC1402105); 国家海洋局公益性科研专项(201205010, 201105023); 科技支撑计划项目(2012BAC07B023)

王淑贤(1990-), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为海藻资源化利用, 电话: 15800728178, Email: Wangshuxian1234567@163.com;何培民, 通信作者, Email: pmhe@shou.edu.cn; 于克锋, 通信作者, Email: kfyu@shou.edu.cn

Apr. 23, 2016

[Nation Natural Science Foundation of China, No.41576163; The National Key Research and Development Plan, No.2016YFC1402105; Public Science and Technology Research Funds Projects of the Ocean, No.201205010, No.201105023; National Science & Technology Pillar Program, No.2012BAC07B03]

(本文编辑: 康亦兼)