吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂联合铝佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效应分析

何 慧, 李彦涵, 李建芳, 马 静, 胡云章, 胡凝珠

(1. 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 云南省虫媒传染病防控研究重点实验室, 昆明650118; 2. 昆明医科大学, 昆明650500)

吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂联合铝佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效应分析

何 慧1, 李彦涵1, 李建芳1, 马 静2, 胡云章1, 胡凝珠1

(1. 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 云南省虫媒传染病防控研究重点实验室, 昆明650118; 2. 昆明医科大学, 昆明650500)

目的 探讨吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂INCB024360类似物与铝佐剂联合对甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l)诱导小鼠体液免疫应答的影响，以评价其复合佐剂效应。方法 分别将三种不同剂量的INCB024360类似物(150 μg, 100 μg, 50 μg)与Al(OH)3(300 μg)复合后与HepA-1共同免疫ICR小鼠分别作为复合佐剂1组，2组，3组，同时设空白对照组、单纯疫苗组、铝佐剂对照组和单一INCB024360类似物(100 μg)组, 共免疫一次，于免疫后 4周、8周、12周、16周进行尾静脉采血, 采用间接 酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清抗甲型肝炎病毒(HAV) IgG 抗体水平。结果 除空白对照组外, 各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周, 均产生抗HAV IgG抗体, 抗体水平随免疫时间的延长逐渐升高, 于12周达到峰值。复合佐剂2组[HepA-118 EU+Al(OH)3300 μg+ INCB024360类似物100 μg]产生的抗体水平最高且持续时间较长, 在8周和12周时, 其对HepA-1的免疫增强效应显著高于单一佐剂组以及铝佐剂对照组(P＜0.05, t值分别为3.169、2.439)。4周、8周、12周、16周, 单一佐剂组与单纯疫苗组差异均不具有统计学意义(P＞0.05)。结论 IDO抑制剂INCB024360类似物与铝佐剂复合后具有较强的复合佐剂效应，免疫增强效应优于铝佐剂对照组; 但是单一的INCB024360类似物不具有显著佐剂效应。

吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO); INCB024360类似物; 疫苗佐剂;甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l); 体液免疫; 佐剂效应

吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)是一种含亚铁血红素的氧化还原单体酶, 是催化犬尿氨酸途径的限速酶，经多步分解代谢将基本氨基酸色氨酸转化为犬尿氨酸[1-3]。IDO是经γ干扰素(IFN-γ)诱导表达在多种细胞内的一种酶，在抗原提呈细胞尤其是浆细胞样树突状细胞内高度表达，该通路可以通过抑制T细胞的活化来下调机体的免疫能力[4]。已被证实IDO与阿尔茨海默病、癌症等多种疾病的发病机制密切相关,可能成为治疗多种疾病的靶标[5]。

研究表明[6]，抑制IDO1的活性不仅可以促进化学治疗的疗效还可以提高免疫接种的效果，这使得IDO1成为一种新的免疫增强设计靶标。相关研究表明[7-9]，经IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan, 1-MT)处理后的慢性粒细胞性白血病源性树突状细胞的IL-12分泌水平及刺激自体T淋巴细胞增殖的能力均明显高于对照组。

IDO抑制剂分为竞争性抑制剂, 非竞争性抑制剂以及反竞争性抑制剂。4-氨基-N-(3-氯-4-氟苯基) -N'-羟基-1,2,5-口恶二唑-3-甲脒(又称INCB024360)是一种口服、强效、选择性的小分子竞争性IDO抑制剂, IC50为10 nmol, 目前作为抗肿瘤药物已经进入II期临床试验[10-12]。临床前试验证明, IDO抑制剂INCB024360 能够促进T细胞、自然杀伤(NK)细胞的生长，减少调节性T细胞(Treg)[13-15]。综上所述, IDO抑制剂在一定程度上可以增强免疫反应。

INCB024360类似物是在INCB024360的基础上进行改造，分子量更小且抑制效果以及安全性更好的IDO抑制剂, 其分子式为C9H7ClFN5O2, 结构式见图1, IC50为67 nmol。鉴于IDO抑制剂INCB024360类似物潜在的免疫增强效应, 推测其具备潜在的疫苗佐剂效应。本文作者选择IDO抑制剂INCB024360类似物作为候选佐剂，通过与HepA-l联合免疫小鼠和与铝佐剂联合后再与HepA-l共同免疫小鼠，以评价其对小鼠体液免疫应答的影响，并分析其潜在的疫苗佐剂效应。

图 1 INCB024360类似物结构式Figure 1 The structural formula of INCB024360 analogue

1 材料与方法

1.1 主要试剂

甲型肝炎减毒活疫苗(HepA-l)，甲型肝炎病毒(HAV)抗原滴度为256 EU/mL, 由中国医学科学院医学生物学研究所提供; 甲型肝炎抗原(HAV颗粒)，由中国医学科学院医学生物学研究所提供; 铝佐剂为Al(OH)3胶体(12.5 mg/mL), 由中国医学科学院医学生物学研究所提供; IDO抑制剂INCB024360类似物购于美国Selleck公司; 血清IgG ELISA 试剂盒，购自美国KPL公司。

1.2 实验动物

清洁级雌性ICR小鼠共42只，5～6周龄，体质量18～22 g，由中国医学科学院医学生物学研究所小动物实验部[SCXK(滇) K2014-0002]提供。试验计划通过医学生物学研究所动物实验伦理委员会审查, 动物饲养设施符合相关标准[SYXK(滇)K2014-0007]。

1.3 动物分组及免疫

将42只雌性ICR小鼠随机分成7组，6只/组，分组情况详见表1。均经背部皮下注射ICR小鼠，200 μL/只。于免疫后的4周、8周、12周和16周,小鼠尾静脉采血，分离血清，以备检测。

表 1 动物分组

1.4 小鼠血清抗-HAV IgG 抗体水平检测

本实验采用间接ELISA法检测小鼠血清抗-HAV IgG 抗体水平。具体操作步骤为: 用包被液稀释甲型肝炎抗原后, 加入酶标反应板中, 100 μL/孔，A1孔不加包被液, 作为空白对照, 并于湿盒中4 ℃包被过夜; 次日用小牛血清(BSA)于37 ℃ 封闭60 min, 200 μL/孔; 待检测小鼠血清自 20倍起倍比稀释, 加入酶标板, 100 μL/孔, 3个阴性对照孔加未免疫小鼠血清，于37 ℃反应 60 min; 洗涤拍净板子后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体, 100 μL/孔,于37 ℃反应 60 min。洗涤酶标板, 并拍净板子后加入四甲基联苯胺(TMB)显色液, 100 μL/孔, 显色30 min; 加入2 moL/L H2SO4, 100 μL/孔，终止显色反应; 于酶标仪405 nm和605 nm双波长检测各孔吸光度(A)值，阳性反应孔的判定cutoff值=3个阴性对照孔平均A值×2.1, 大于cutoff值判定为阳性，小于等于cutoff值判定为阴性, 以阳性反应孔的最大稀释度作为该孔的抗体效价, 以log10 表示。

1.5 统计学分析

数据以均值±标准差表示, 应用Graphpad prism 5软件进行统计学分析, 组间比较采用t检验, P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

除空白对照组外，各组小鼠在免疫后4周、8周、12周、16 周，均产生抗-HAV IgG，抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于12周达到峰值，此后逐渐下降。

4周、8周、12周, 三个剂量的复合佐剂组抗体水平显著高于单纯疫苗组(P＜0.05), 复合佐剂1组4周、8周、12周的t值分别为3.901、2.610、4.188，复合佐剂2组的t值分别为5.482、4.427、3.769，复合佐剂3组的t值分别为3.221、 2.457、2.589; 第16周，复合佐剂2组的抗体水平显著高于单纯疫苗组(P＜0.05，t=3.100); 复合佐剂1组和复合佐剂3组的抗体水平也高于单纯疫苗组但差异不具有统计学意义。

4周、8周、12周、16周，单一佐剂组与单纯疫苗组差异不具有统计学意义。表明单一的INCB024360类似物不具有显著佐剂效应。4周、8周、12周和16周，复合佐剂2组的抗体水平高于其他两组复合佐剂组但差异不具有统计学意义。

8周、12周, 复合佐剂2组的抗体水平显著高于铝佐剂对照组(P＜0.05，8周、12周的t值分别为3.169、2.439); 其余两组复合佐剂组的抗体水平高于铝佐剂对照组但差异不具有统计学意义; 4周、16周, 三组复合佐剂组的抗体水平与铝佐剂对照组差异不具有统计学意义。表明INCB024360类似物与Al(OH)3复合佐剂可增强HepA-l诱导的特异性体液免疫应答, 具有佐剂效应, 较佳剂量为100 μg/组(图2)。

图 2 不同时间各组小鼠血清抗-HAV IgG 水平Figure 2 Anti-HAV IgG titers in sera of mice in different groups at 4, 8, 12 and 16 weeks

3 讨论

佐剂是一种能够增强疫苗组分抗原特异性免疫应答或改变免疫反应的物质[16]。铝佐剂是最早被批准用于人类疫苗的佐剂, 其优点突出, 如铝佐剂安全性较高，价格便宜，引起的免疫应答持续时间较长。Al(OH)3佐剂经长期实践证实了其安全高效等特点[17]，但其与许多新型疫苗如重组蛋白和亚单位疫苗抗原共同免疫时不能有效的激发免疫应答, 使之很难满足新型疫苗发展的需要。随着生物技术的发展，尽管已有大量的新型疫苗佐剂处于研究开发和临床试验阶段, 但是真正获得批准用于人用疫苗的佐剂屈指可数。MF59是第二个被批准用于人类疫苗的疫苗佐剂, 作为新型疫苗佐剂, MF59比铝佐剂更适合应用于流感疫苗, 但在实施接种过程中易造成短暂性剧痛, 引起局部强烈的炎症反应而且不能有效的激发细胞免疫。因此,目前新型疫苗佐剂的主要研发任务是寻找一种不仅安全可靠而且能很好的增强体液免疫和细胞免疫的疫苗佐剂。

复合佐剂是将两种或多种不同作用机制的佐剂混合使用，进一步增强或调节对某一抗原的免疫应答[18]。将不同类型的佐剂复合研制新型疫苗佐剂成为佐剂发展的新趋势。王丽萍等[19]将酵母多糖与角鲨烯两种物质联合使用作为复合佐剂，适当配比的复合佐剂能显著增强甲型肝炎抗原的体液免疫应答且效果优于铝佐剂。王琳等[20]将内源性危险信号分子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)与具有佐剂效应的铝佐剂联合使用，结果表明NAD与Al(OH)3联合佐剂能显著增强乙肝抗原诱导的体液免疫应答且效果优于单一铝佐剂以及单一NAD佐剂。

本实验为了探究IDO抑制剂作为新型疫苗佐剂的可行性，将不同剂量的INCB024360类似物和Al(OH)3复合使用，初步研究其对HepA-l诱导的小鼠体液免疫应答。结果显示，INCB024360类似物和Al(OH)3联合的复合佐剂可以显著增强HepA-l诱导的体液免疫应答。适当剂量的复合佐剂的增强效应显著高于单一铝佐剂和单一INCB024360类似物佐剂。但单一INCB024360类似物不具有显著的佐剂效应, 原因是IDO是由炎性因子诱导表达的[21,22]，而单纯HepA-l不足以引起较强的免疫反应; 也可能是因为Al(OH)3可以吸附INCB024360类似物起到缓释作用，从而引起高效而持久的免疫应答。

IDO抑制剂INCB024360类似物和Al(OH)3复合佐剂有望成为HepA-1新型佐剂。下一步将细化INCB024360类似物的剂量分组，降低铝佐剂剂量，进一步研究其作为佐剂的安全性和有效性。

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Effects of Indoleamine-2,3-dioxygenase Inhibitor Combined with Aluminum Adjuvant on Humoral Immune Response Induced by Hepatitis A Virus Attenuated Live Vaccine in Mice

HE Hui1, LI Yan-han1, LI Jian-fang1, MA Jing2, HU Yun-zhang1, HU Ning-zhu1
(1. Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Prevention & Control Research on Insect-Borne Infectious Diseases, Kunming 650118, China; 2. Kunming Medical University, Kunming 650500, China)

ObjectiveTo investigate the compound effect of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) inhibitor INCB024360 analogue combined with aluminum adjuvant on humoral immune response induced by hepatitis A virus (HAV) attenuated live vaccine(HepA-l) in mice.MethodsThe ICR mice were injected respectively with HepA-l (18EU) and Al(OH)3(300 μg) and three different doses (150 μg, 100 μg, 50 μg) of INCB024360 analogue as experimental group, 200 μL for each and one immunization. At the same time, set up the blank group, pure vaccine group, aluminum adjuvant control group and single INCB024360 analogue (100 μg) group. The sera from tail vein blood of mice were collected at the end of 4, 8, 12 and 16 weeks after immunization and the specific IgG antibody against HAV were detected by indirect ELISA method.ResultsIn addition to the blank group, mice in various group generated anti-HAV IgG at 4, 8, 12, 16 weeks after the immunization. The antibody levels increased as time went on and reached peak at 12 weeks, then decreased gradually. The antibody level of compound adjuvant 2 group is the highest. At 8, 12 weeks, the antibody level was significantly higher than pure vaccine group, aluminum adjuvant control group and single INCB024360 analogue group (P＜0.05). At 4, 8, 12, 16 weeks, the difference between the single adjuvant group and the simple vaccine group was not statistically significant.Conclusions The compound adjuvant of IDO inhibitor INCB024360 analogue combined with aluminum adjuvant can obviously enhance the HepA-l induced humoral immune response in mice, and the immunity enhancement effect is better than aluminum adjuvant control group. But the single INCB024360 analogue does not have significant adjuvant effect.

Indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO); INCB024360 analogue; Vaccine adjuvant; Hepatitis A virus attenuated live vaccine (HepA-l); Humoral immunity; Adjuvant effect

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0108-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.005

2017-01-16

国家科技支撑计划项目(2014BAI01B01); 云南省创新团队“中国医学科学院医学生物学研究所新型疫苗佐剂应用研究省创新团队”(2011CI140);国家自然科学基金项目(31500748); 国家重点研究计划生物安全关键技术研究发重点专项(2016YFC1202300)

何 慧(1990-), 女, 硕士研究生, 专业: 生物化学与分子生物学, E-mail: 1129368425@qq.com

胡凝珠(1961-), 女, 主任技师,

E-mail: huningz@126.com