生化标记方法在KM小鼠遗传结构分析中的应用

王 洪, 魏 杰, 李晓波, 巩 薇, 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院, 北京 100050)

生化标记方法在KM小鼠遗传结构分析中的应用

王 洪, 魏 杰, 李晓波, 巩 薇, 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院, 北京 100050)

目的 利用生化标记检测法分析1990年和2010年KM小鼠群体遗传结构的变化。方法 采用国家标准GB/T 14927.1-2008推荐的生化标记检测法对同一种群的来源KM小鼠(1990年的18只和2010年的50只)进行遗传质量检测，借助统计软件POPGENE 1.32进行群体遗传结构分析。结果 1990年群体的平均杂合度是0.262 5，多态性信息含量是0.206 5。2010年群体的平均杂合度是0.161 5，多态性信息含量是0.130 7。群体间比较显示，群体间分化系数为0.122 4，遗传距离为0.095 1。结论 经过20年的封闭繁育，该KM小鼠群体出现了中度的遗传分化，但仍属于同一品系(同种同属)的小鼠群体。

KM小鼠; 遗传结构; 生化标记

KM小鼠的前身是1926年美国Rockfeller研究所从瑞士引入白化小鼠培育成瑞士种小鼠, 1946年从印度Haffkine研究所引入我国云南昆明，1952年由昆明引入北京生物制品研究所, 1954年推广到全国使用的一种封闭群小鼠。KM小鼠的特点是抗病力和适应力很强, 繁殖率和成活率高。常见自发性肿瘤为乳腺癌(发病率25%)，是我国应用最多的实验小鼠, 广泛应用于药理、毒理、病毒和细菌引起的传染病的研究中, 以及生物制品的检定工作中[1]。

本研究中, 应用生化标记方法对同一来源种群KM小鼠进行了遗传结构分析。比较1990年和2010年该群KM小鼠群体遗传结构的变化, 并探索生化标记检测法用于评价封闭群小鼠遗传质量的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级KM小鼠，雌雄各半，68只，8周龄，国家啮齿类实验动物种子中心提供[SCXK(京)2005-0004]，饲养于屏障设施[SYXK(京)2011-0008]。其中18只动物为1990年的KM小鼠，50只动物为2010年的KM小鼠。1990年KM小鼠的检测工作已于当年完成，2010年KM小鼠的检测工作已于2010年完成。两个年份的检测数据均属首次发表。

1.2 试剂和仪器设备[2]

染色试剂购自美国Sigma公司; 电泳缓冲液相关试剂购自国药集团化学试剂有限公司; BIO-RAD Model 3000Xi电泳仪购自美国BIO-RAD公司; 乙酸纤维素薄膜购自浙江台州路桥四甲生化塑料厂。

1.3 生化标记方法

具体方法参见GB/T14927.1-2008 近交系小鼠、大鼠生化标记检测法[2]。测定项目: 酯酶-1(Es1)，转铁蛋白(Trf), 碳酸酐酶-2(Car2), 葡萄糖磷酸异构酶-1(Gpi1)，血红蛋白β链(Hbb)，酯酶-10(Es10)，酯酶-3(Es3)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1(Gpd1)，磷酸葡萄糖变位酶-1(Pgm1)，碱性磷酸酶-1(Akp1)，肽酶-3(Pep3)，苹果酸酶-1(Mod1)，异柠檬酸脱氢酶-1(Idh1)，过氧化氢酶-2(Ce2)。

1.4 数据统计分析

运用POPGEN1.32软件，分析14个生化标记位点的等位基因数、有效等位基因数、香隆指数和平均杂合度。利用Cervus3.0软件计算群体平均多态信息含量(PIC)。按照Nei(1978)氏法计算封闭群小鼠群体的遗传一致性指数和遗传距离[3]。

2 结果

2.1 1990年生化标记检测结果

1990年18只KM小鼠的生化标记检测结果见表1和表2。

14个生化标记位点共检测出23个等位基因，各基因座等位基因数1～2个不等，其中5个基因座(Es1、Trf、Akp1、Pep3、Idh1)呈现单态性，只有1个等位基因，平均等位基因数为1.642 9。平均杂合度为0.262 5。Hardy-Weinberg遗传平衡P值中，有6个位点P＞0.05。利用Cervus3.0软件统计得到该群体的14个生化标记位点的平均多态性信息含量(PIC)为0.206 5。剔除5个单态性位点，剩余9个位点的PIC为0.321 2。

2.2 2010年KM小鼠的生化标记检测结果

2010年50只KM小鼠的生化标记检测结果见表3和表4。在14个生化标记位点共检测出22个等位基因, 各基因座等位基因数1～2个不等, 其中7个基因座(Es1、Trf、Gpi1、Gpd1、Akp1、Pep3、Idh1)呈现单态性，只有1个等位基因, 平均等位基因数为1.571 4。平均杂合度为0.161 5。Hardy-Weinberg遗传平衡P值中，有2个位点P＞0.05。利用Cervus3.0软件统计得到该群体的14个生化标记位点的PIC为0.130 7。剔除7个单态性位点，剩余7个位点的PIC为0.261 4。

2.3 两个年份群体遗传相似性比较

将1990年KM小鼠生化标记检测结果与2010年的检测结果进行比较，表明等位基因数、平均杂合度、PIC等相关指标有一定的差异，1990年的结果略高于2010年的结果。两个群体的PIC值均低于0.25，属于低度多态性群体。在测定的14个位点中，两个群体均有5～7个单态性位点，其中5个位点(Es1、Trf、Akp1、Pep3、Idh1)一致。两组数据中有5个显著性差异的位点，分别是Car2，Gpi1，Gpd1和Ce2 (P＜0.01); 和1个位点Mod1(0.01＜P＜0.05)。

进一步分析两个群体的群间分化系数(Fst)、遗传一致性指数和遗传距离，结果见表5。

3 讨论

3.1 平均杂合度、多态性信息含量和遗传平衡

较理想的封闭群群体的杂合度值应介于0.5～0.7[4]。本研究中1990年该KM小鼠群体的平均杂合度是0.262 5, 2010年该群体的平均杂合度是0.161 5。1990年的数据略高于2010年的数据。显然，两个年度的群体杂合度都没有达到0.5～0.7，都不是理想的封闭群小鼠群体。多态性信息含量是表示生化标记多态性高低的一个指标。本研究中1990年该小鼠群体的平均多态性信息含量为0.206 5, 2010年该群体的平均多态性信息含量为0.130 7。两个年份的多态性信息含量均小于0.25，为低度多态性群体。如果排除单态性位点，1990年和2010年的PIC分别为0.321 2和0.261 4，介于0.25～0.5，为中度多态性群体。Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果显示，1990年该群体小鼠有6个位点处于遗传平衡(P＞0.05), 高于2010年该群体小鼠, 后者仅有2个位点(P＞0.05)。说明该群体的平均杂合度和多态性信息含量都有下降的趋势，同时也表明单态性位点不适用于封闭群群体的遗传结构分析，应增加多态性位点的数量替代单态性位点，以提高生化标记检测法的检测效率。在封闭繁育过程中，可能由于群体规模的限制, 繁殖方式的不规范, 造成基因多态性的递减, 进而出现群体遗传结构特征的变化。研究结果提示对封闭群实验动物群体定期(国家标准规定是1年)进行遗传质量监测的必要性。同时也证明生化标记检测法用于群体遗传质量评价的可行性。

表 1 1990年KM小鼠生化标记检测结果Table 1 Biochemical marker testing result at 1990 in KM mice

表 2 1990年KM小鼠在14个生化标记位点上的等位基因数、平均杂合度、多态性信息含量Table 2 Allele number, average heterozygosity and polymorphism information content (PIC) of 14 biochemical loci at 1990 in KM mice

表 3 2010年KM小鼠生化标记检测结果Table 3 Biochemical marker testing result at 2010 in KM mice

续表3

3.2 群间分化系数、遗传一致性指数和遗传距离

群间分化系数(Fst)是测定群体间遗传分化的主要参数，Fst＜0.05时，表示群体间有轻度遗传分化; 0.05≤ Fst＜0.15时，表示群体间有中度遗传分化; 0.15≤Fst＜0.25时，表示群体间有中重度遗传分化; Fst≥0.25时，表示群体间有重度遗传分化，群体差异显著[5]。本研究中两个年份KM小鼠群体的群间分化系数为0.122 4，介于0.05和0.15，表明两个群体间产生了中度的遗传分化。遗传一致性指数与遗传距离是反映群体遗传相似性的两个指标，两者呈负对数关系，其中，遗传距离为显性函数，且当遗传距离大于0.2时，认为两个群体为同属不同种; 在0.03～0.2时为同属同种[5]。本研究中两个年份该小鼠群体的遗传一致性指数为0.909 3;遗传距离介于0.03和0.2，为0.095 1，表明这该群体仍属于同种同属(同一品系)的动物。研究结果表明该KM小鼠群体的遗传结构已经发生了改变，但仍属于同一个品系的动物。繁育机构可以根据检测结果适时调整繁育和生产计划，达到控制封闭群群体遗传质量的目的。

表 4 2010年KM小鼠在14个生化标记位点上的等位基因数、平均杂合度、多态性信息含量Table 4 Allele number, average heterozygosity and polymorphism information content (PIC) of 14 biochemical loci at 2010 in KM mice

表 5 两个KM小鼠群体的遗传参数Table 5 Genetic parameters in two colonies of KM mice

3.3 生化标记方法的局限性

1994年实验动物相关国家标准首次发布，2001年经过第一次修订, 两个版本中均未提及封闭群动物的遗传质量监测。从1994至2010年的16年中封闭群群体遗传质量控制处于缺失状态。2010年12月23日 “GB 14923-2010哺乳类实验动物的遗传质量控制”正式发布，替代原有版本GB 14923-2001, 其重大变化在于新增的指导原则: 要求对封闭群动物进行遗传质量检测。具体的检测方法推荐使用生化标记检测法、下颌骨测量法、DNA检测法等。其中生化标记检测法是“GB/T 14927.1-2008近交系小鼠、大鼠生化标记检测法”。此前，该方法主要用于对近交系动物进行遗传质量控制。

研究结果表明，1990年的群体表现为多态性的两个位点(Gpi1和Gpd1)，在2010年的群体中已经呈现为单态性了。1990年和2010年两组数据中有5个显著性差异的位点, 分别是Car2, Gpi1, Gpd1和Ce2 (P＜0.01); 和1个位点Mod1(0.01＜P＜0.05)。占总数(14个位点)的35.71%。说明群体的遗传结构特征已经发生变化，群体的杂合程度趋于减弱。遗传背景发生改变的实验动物必然对该动物参与的医学实验结果产生影响。因此, 应重视封闭群动物群体遗传质量的评价，减少和避免由此给科研工作带来的负面影响。实验动物遗传监测生化标记分析法, 是通过蛋白质的变化推测相应基因的变化[6-7]。生化标记分析在近交系动物遗传检测中，具有检测的基因位点明确、方法简便快速、比较经济等优点[5]。本研究数据揭示了该KM小鼠群体的群体遗传结构特征的变化趋势。但是, 14个位点中有近50%的位点已经表现为单态性。单态性的位点对于群体遗传结构的评价来说, 是无效的位点。本研究中的有效位点为7～9个, 位点太少的情况下, 并不能客观真实地反映群体的遗传结构特征。因此, 生化标记方法需要进一步完善，应增加多态性丰富的位点的数量, 并且位点应全面覆盖小鼠的所有染色体。

综上，本文应用生化标记检测法对封闭群KM小鼠群体进行了遗传质量检测，分析了同一个饲养设施内20年前后同一品系封闭群小鼠的遗传结构的变化，结果表明该群体的群体遗传结构已经发生变化。封闭群实验小鼠的群体遗传结构特征处于动态变化之中，应定期对封闭群群体的遗传质量进行监测，来保证封闭群实验小鼠的群体遗传结构处于动态平衡之中。进而保证动物实验结果的可靠性和可比性。本研究结果也为生化标记检测方法应用于封闭群小鼠的群体遗传质量控制提供了数据支撑。(致谢：特别感谢贺争鸣研究员对本文的耐心指导。)

[1] 魏泓. 医学实验动物学[M]. 四川: 四川科学技术出版社, 1998.

[2] GB/T14927.1-2008. 近交系小鼠、大鼠生化标记检测法[S].

[3] Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals [J]. Genetics, 1978, 89(3):583-590.

[4] 王洪, 杜小燕, 徐平, 等. 上海KM小鼠种子群体遗传状况分析[J]. 中国比较医学杂志, 2014, 24(12):27-32.

[5] 魏杰, 王洪, 李芳芳, 等. 两个封闭群NIH小鼠群体的遗传监测结果的比较分析[J]. 中国比较医学杂志, 2015, 25(5): 33-36.

[6] 李瑞生, 陈振文, 栾蓉晖, 等. 近交系大鼠微卫星DNA与生化标记分析的比较研究[J]. 中国实验动物学杂志, 2002, 12(4):225-228.

[7] 陈振文, 李瑞生, 王冬平, 等. DNA指纹图与生化标记分析对近交系小鼠遗传检测的比较[J]. 中国兽医学报, 2001, 21(6):627-630.

Application of Biochemical Markers on Analysis of Population Genetic Structure in KM mice

WANG Hong, WEI Jie, LI Xiao-bo, GONG Wei, YUE Bing-fei
(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050 China)

ObjectiveTo analyze the change of genetic structure of KM mice colonies between 1990 and 2010.MethodsKM mice colonies (18 mice in 1990 and 50 mice in 2010) were monitored by biochemical markers under instruction of national standard GB/T 14927.1-2008. POPGENE 1.32 software was used to process the data.ResultsIn 1990, average heterozygosity is 0.262 5, polymorphism information content is 0.206 5. In 2010, average heterozygosity is 0.161 5, polymorphism information content is 0.130 7. By compared with the two colonies, population differentiation coefficient is 0.122 4 and the genetic distance is 0.095 1.ConclusionAfter 20 years outdred, the KM colony has medium change of population differentiation , but still be considered as same strain from the point of population genetics.

KM mice; Genetic structure; Biochemical markers

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0144-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.012

2016-11-28

王 洪(1977-), 女, 副研究员。研究方向: 实验动物质量控制。E-mail: littstar@163.com

岳秉飞(1960-), 男, 博士, 研究员。E-mail: y6784@126.com