针药结合对失眠大鼠血液中单胺类神经递质的影响

许贵军，车明徽，隋金婷，张哲源，齐 威，孙忠人△

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江哈尔滨 150025；3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

实验研究

针药结合对失眠大鼠血液中单胺类神经递质的影响

许贵军1，车明徽1，隋金婷2，张哲源1，齐 威3，孙忠人3△

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江哈尔滨 150025；3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究针药结合方法对失眠模型大鼠血液中5-HT、5-HIAA、NE、DA等4种单胺类神经递质的影响。方法：50只健康Wistar大鼠，随机分为5组，每组10只。分别为空白对照组、失眠模型组、五加枣仁膏滋组、电针组和针药结合组，除空白组外，其他各组采用PCPA腹腔注射造失眠模型。针刺采用电针仪对大鼠百会与左神聪穴，电压9 V，选疏密波，留针30 min，连续7天；膏滋以1.35 g/(kg·d)剂量灌胃，连续7天，末次针刺或灌胃后，眼球取血，采用HPLC-荧光检测法，色谱条件为C18反相色谱柱，甲醇：柠檬酸-乙酸钠缓冲液(13∶87，v/v)；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；发射波长为330 nm，激发波长为280 nm，同时测定大鼠血浆中5-HT、5-HIAA、NE、DA。结果：针药结合组NE含量极显著高于空白对照组(P<0.01)，并显著低于失眠模型组(P<0.05)，分别与五加枣仁膏滋组和电针组进行比较，无显著性差异。针药结合组DA含量极显著低于失眠模型组(P<0.01)，分别与五加枣仁膏滋组和电针组进行比较，均具有极显著性差异(P<0.01)。针药结合组5-HT转换率分别与五加枣仁膏滋组和电针组进行比较，数值较低，均具有极显著性差异(P<0.01)。结论：针药结合组与五加枣仁膏滋组和电针组进行疗效比较，具有显著促眠优势,说明针药结合对失眠大鼠的促眠作用具有协同增效性。

针药结合；失眠；单胺类神经递质；协同增效;大鼠

百会穴和神聪穴是针灸治疗失眠症的经典穴位，五加枣仁膏滋为黑龙江中医药大学附属第二医院的特色制剂，按照传统膏方制备工艺精制而成，健脾补肾、宁心安神,用于体虚乏力、食欲不振、虚烦不眠多梦等症。脑组织或血液中单胺类神经递质及其代谢产物的含量变化，都可反映神经系统功能的变化[1-2],对睡眠产生影响。本研究通过对失眠模型大鼠针刺结合灌胃给药，测定血浆中5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量，得到其变化规律。证实针药结合治疗失眠症的协同增效作用。

1 实验材料

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪(Waters 2695型、2475型荧光检测器、3.2色谱工作站)；高速冷冻离心机(科大创新有限公司中佳分公司KDC-160HR)；超低温冰箱(赛默飞 Thermo HFU586 Basic)；电针仪(江苏武进市长城医疗器械有限公司KWD-808 I)；针灸针(苏州医疗仪器厂0.30 mm×25 mm)；肝素纳采血管(VACUETTE)；涡旋混合器(苏州江东精密精密仪器有限公司)。

1.2 试剂试药

五加枣仁膏滋(黑龙江中医药大学附属第二医院制剂室，20131001)；5-HT(Maya Reagent)；5-HIAA(上海源叶生物科技有限公司)；NE(Maya Reagent)；DA(Aladdin Industrial Corporation)；盐酸(哈尔滨市化工试剂厂,20120115)；柠檬酸(天津市北方天医化学试剂厂,20121203)；冰醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司,20120502)；无水醋酸钠(天津市光复科技发展有限公司,20111201)；EDTA- 2Na(天津市华真特种化学试剂厂,20120104)；1-庚烷磺酸钠(天津市大茂化学试剂厂,20110309)；三乙胺(天津市富宇精细化工有限公司,20130403)；甲醇(色谱纯DikmaPure LOT：5305915)；PCPA(北京百灵威科技有限公司)；高氯酸(天津市科密欧化学试剂有限公司,20120502)。

1.3 实验动物

健康Wistar大鼠50只，雄性，体质量200～250 g(黑龙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK黑2013-004，使用许可证：SYXK黑2013-012)。

2 实验方法

2.1 色谱条件与检测方法

2.1.1 色谱条件和荧光检测参数 色谱柱：Kromasil C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 um)。流动相为甲醇：柠檬酸-乙酸钠缓冲液(13：87，v/v)(pH3.8)，缓冲液按照50 mmol/L柠檬酸、50 mmol/L乙酸钠、0.5 mmol/L1-庚烷磺酸钠、5 mmol/L 三乙胺、0.5 mmol/L EDTA-2Na比例配制；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；发射波长为330 nm，激发波长为280 nm[3-4]。

2.1.2 血浆中5-HT、5-HIAA、NE、DA含量测定 各组大鼠于末次针刺或给药后，禁食8 h对大鼠作相应处理，对各组动物按照相应顺序取眼球血，置于肝素钠管内，放置于高速冷冻离心机中以4800转/min，4℃离心15 min，离心后取上清液置于-84℃超低温冰箱中冷冻待测。血浆样本处理：指标测试之前将血浆样本从超低温冰箱中取出，恒温解冻。解冻后加0.2倍剂量浓度为70%的高氯酸沉淀蛋白质，然后以10000转/min，4℃离心10 min，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤。将处理好的各组血浆样本进样2 μL，根据所得峰面积代入回归方程，计算4种神经递质的浓度。

2.2 造模、分组与给药

2.2.1 失眠动物模型 PCPA腹腔注射造大鼠失眠模型是目前公认并广泛用于5-HT及其与其他递质之间关系研究的经典动物模型[5]。对Wistar大鼠一次性腹腔注射PCPA混悬液45 mg/1 ml/100 g，在腹腔注射PCPA28～30 h后，活动明显频繁，对外界的声、光等刺激异常敏感，兴奋性增高，攻击性增强，饮食及二便显著性增多，大便色灰白，昼夜节律紊乱，白天也活动不停，表明模型复制成功。

2.2.2 动物分组 取大鼠50只，按随机数字表法分为以下5组，每组10只。①空白对照组：腹腔注射与PCPA同体积的弱碱性生理盐水1次，之后连续7天灌胃与五加枣仁膏滋组相同体积的生理盐水；②失眠模型组：失眠模型大鼠，连续7天灌胃与五加枣仁膏滋组相同体积的生理盐水正常饲养7天；③五加枣仁膏滋组：失眠模型大鼠，连续7天给予五加枣仁膏滋灌胃实验，按1.35 g/kg/天给予大鼠五加枣仁膏滋灌胃；④电针组：失眠模型大鼠，连续7天给予电针刺激实验；⑤针药结合组：失眠模型大鼠，连续7天给予五加枣仁膏滋灌胃，同时连续7天给予电针实验。

2.2.3 针刺取穴与施针给药方法 穴位选择百会与左神聪穴。选用0.30 mm×25 mm毫针刺入穴位后连接电针仪，电池供电，电压9 V，选疏密波，强度以头部轻微抽动为度，留针30 min，以上方法连续实验7天，每天早上6:00～7:00针刺。每天早上9:00膏滋灌胃，连续7天。

2.3 统计学方法

3 实验结果

3.1 神经递质的标准曲线回归方程及色谱图

标准曲线分别为，5-HT：y=11067780x+86600；5-HIAA：y=18168613x-4443；NE：y=24953675x+44505；DA：y=64021775x-91322。

色谱图中峰1：NE约2.5 min出现;峰2：DA约3.6 min出现;峰3：5-HIAA约6.6 min出现;峰4：5-HT约16.3 min出现。色谱图见图1、图2。

3.2 大鼠血浆中NE、DA、5-HT、5-HIAA含量的测定

NE、DA结果见表1，5-HT、5-HIAA结果见表2。

图1 4种神经递质混合对照品高效液相色谱图(峰1：NE，峰2：DA，峰3：5-HIAA，峰4：5-HT)

图2 实验大鼠血浆中4种神经递质高效液相色谱图

组别例数NE(pg/mL)DA(ng/mL)空白对照组100．7030±0．26110．0915±0．0173失眠模型组101．6941±0．5920∗∗0．1329±0．0194∗∗五加枣仁膏滋组101．2642±0．4352∗∗#0．0753±0．0082∗##电针组101．2526±0．5093∗∗#0．0722±0．0094∗##针药结合组101．1625±0．3940∗∗#0．0497±0．0104∗∗##△△▲▲

注：与空白对照组比较,*P<0.05，**P<0.01；与失眠模型组比较,#P<0.05，##P<0.01；与五加枣仁膏滋组比较,△P<0.05，△△P<0.01；与电针组比较,▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 各组实验大鼠血浆5-HT和5-HIAA含量的比较

注：与空白组比较,*P<0.05，**P<0.01；与失眠模型组比较,#P<0.05，##P<0.01；与五加枣仁膏滋组比较,△P<0.05，△△P<0.01；与电针组比较,▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表1可见，①各实验组大鼠血浆中NE含量，失眠模型组大鼠极显著高于对照组(P<0.01)；五加枣仁膏滋组、电针组、针药结合组也极显著高于空白对照组(P<0.01)，但3组数据值处于空白对照组与失眠模型组之间，并显著低于失眠模型组(P<0.05)；而针药结合组分别与五加枣仁膏滋组和电针组进行比较，无显著性差异。②各实验组大鼠血浆中DA含量，失眠模型组大鼠极显著高于空白对照组(P<0.01)；五加枣仁膏滋组、电针组、针药结合组含量极显著低于失眠模型组(P<0.01)；相对于空白对照组，膏滋组、电针组显著低(P<0.05)；而针药结合组分别与五加枣仁膏滋组和电针组进行比较，均具有极显著性差异(P<0.01)。

由表2可见，5-HT转换率(5-HIAA/5-HT)方面，失眠模型组大鼠最高，较空白组有极显著性差异(P<0.01)，五加枣仁膏滋组、电针组、针药结合组均极显著低于空白对照组和失眠模型组(P<0.01)；而针药结合组分别与五加枣仁膏滋组和电针组进行比较，数值较低，均具有极显著性差异(P<0.01)。

4 讨论

睡眠是一个十分复杂的生理过程，睡眠的产生与中枢神经某些结构以及不同递质的作用密切相关。针药结合顾名思义是针灸结合药物对疾病进行治疗，是体现中医理论、中医特色的重要手段之一，针药结合产生疗效的机制是一个典型的多因素、多水平的问题，针灸、药物作用机制具有多途径、多层次、多靶点等特点。本研究即从神经递质角度研究针药结合的作用机理。

从实验中得到4种单胺类神经递质的含量变化规律，之所以呈现出以上规律，可能因为:①NE和DA均为参与觉醒的神经递质，属于兴奋性神经递质，一般规律为二者含量越高动物越清醒，而且DA是NE的前体物质，二者含量变化趋势基本一致。失眠模型大鼠的NE、DA升高是因为造模后兴奋度提高所致，经药物、针刺、针药结合干预后，实验组大鼠血浆中NE、DA含量降低，说明各实验手段能够使实验动物的失眠状态得到改善，而从DA数据看，针药结合组的效果最佳。②5-HT、5-HIAA含量变化规律用5-HT转换率即(5-HIAA/5-HT值)来进行促眠效果分析，而不用单纯的5-HT、5-HIAA含量数值来判断，其机理阐述为细胞外的、能够检测到的5-HT并不能完全反映5-HT能神经元的兴奋性。所以，目前许多研究者将5-HT转换率作为5-HT能神经元兴奋性的指标[6-8]。延长觉醒可增加5-HT转化率，也揭示了觉醒状态的维持又必须依赖于高水平的5-HT释放。

从本实验结果可以看出，从单胺类神经递质的角度研究，应用五加枣仁膏滋、电针针刺以及二者相结合的手段，均能改善失眠大鼠的睡眠状态，而针药结合的促眠作用最佳。同时参考各组大鼠行为学表现确定针药结合方式相对于单纯用针或单纯用药对失眠大鼠的睡眠改善具有更佳效果，体现出针药结合对于失眠症的治疗优势。

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许贵军(1975-)，男，副主任药师，研究方向：新制剂新剂型研究。

△通讯作者：孙忠人(1960-)，男，教授，博士后合作指导教师,研究方向：中医针灸治疗脑病。

R246.1

A

1005-0779(2017)04-0058-03

2016-08-30