非小细胞肺癌患者DC-CIK过继免疫治疗前后外周血TLR4表达的变化
2017-05-04王细勇袁琳娜张志豪
王细勇 袁琳娜 张志豪
非小细胞肺癌患者DC-CIK过继免疫治疗前后外周血TLR4表达的变化
王细勇 袁琳娜 张志豪
目的 观察细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）过继免疫治疗前后非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血单个核细胞（PBMC）Toll样受体4（TLR4）mRNA表达变化,及脂多糖刺激下PBMC分泌细胞因子的变化,探讨TLR4在DC-CIK过继免疫治疗中的作用。方法 对50例采用DC-CIK治疗的NSCLC患者，运用RT-PCR检测治疗前后PBMC TLR4mRNA表达变化，ELISA法检测治疗前后NSCLC患者PBMC在脂多糖刺激下细胞因子（IL-6、IL-8及TNF-α）分泌的变化。 结果 DC-CIK治疗后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA的表达水平较治疗前显著降低（t=6.272，P＜0.01）；脂多糖刺激下PBMC分泌IL-6（t=17.407，P＜0.01）、IL-8（t=15.244，P＜0.01）及TNF-α（t=12.428，P＜0.01）显著减少。 结论 DC-CIK过继免疫治疗可能通过降低PBMC TLR4mRNA的表达，提高机体抗肿瘤免疫功能。
树突状细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 非小细胞肺癌 TLR4
肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤[1]。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌总数的85%，5年生存率仅为15%。目前对于NSCLC的治疗除了手术、放疗、化疗等传统手段外，又出现了靶向治疗、免疫治疗等新兴疗法。其中，DC-CIK细胞疗法是过继细胞免疫治疗的首选方案[2]。研究表明，DC-CIK细胞治疗能显著提高NSCLC患者的生存期[3]。Toll样受体4（TLR4）是连接固有免疫及适应性免疫的重要桥梁，表达于多种免疫细胞[4]。本研究将通过比较NSCLC患者DC-CIK治疗前后外周血单个核细胞（PBMC）TLR4mRNA表达及功能变化，探讨TLR4在过继细胞免疫治疗中的作用机制及地位，为NSCLC的DC-CIK的治疗提供理论依据。
1 对象和方法
1.1 对象 2012年6月至2014年6月，武警浙江总队嘉兴医院胸心外科就诊并经病理检查确诊的NSCLC患者50例，均行DC-CIK治疗。50例NSCLC患者中，男31例，女19例，年龄38～78（62.24±8.62）岁。肺腺癌22例，鳞状细胞癌28例。高分化癌11例，中低分化癌39例。有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者19例。吸烟36例，不吸烟14例；TNM分期根据2009年国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期11例，无Ⅳ期患者。患者均接受过肺癌的规范化治疗（包括手术治疗及放、化疗等）；血常规正常，心、肝、肾功能可耐受生物治疗；Karnofsky功能状态评分（KPS评分）＞60分；末次治疗至开始接受DC-CIK细胞免疫治疗的间隔时间≥4周；手术患者切口完全愈合；无感染、其他恶性肿瘤及传染性疾病；对生物制品无过敏。
1.2 主要试剂 淋巴细胞分离液购自北京赛驰生物科技有限公司；肿瘤细胞株购自金斯瑞生物科技有限公司；重组人IFN-γ、IL-2、GM-CSF、IL-4、TNF-α均购自上海高创化学科技有限公司；抗人CD3单抗购自北京思科达生物科技有限公司；胎牛血清为美国Hyclone公司产品，RPMI-1640培养基为美国Gibco产品。总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及DNA ladder均购自TAKARA公司；TaqDNA聚合酶，dNTP均购自天为时代公司；TLR4（622 bp）引物：5′-CTGCAATGGATCAAGGACCA-3，5′-TCCCACTCCAGGTAAGTGTT-3′；βactin（374 bp）引物：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTGTGC-3′，5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3′；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。人IL-6、IL-8及TNF-α双抗夹心Elisa检测试剂盒购自上海巧伊生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 抗原制备方法 根据患者肿瘤类型选择相同病理的肿瘤细胞株制备抗原。取对数生长期的细胞株细胞，加入0.9%氯化钠溶液调细胞数至5×106/ml，反复冻融（-196～37℃）12次。细胞裂解物经12 000r/min离心5min，取上清液备用。
1.3.2 DC-CIK细胞制备诱导方法 无菌抽取患者外周血50ml，常规Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，加入适量RPMI-1640培养液，调整细胞浓度至2×106/ml，加入培养瓶中，置于37℃，5%CO2的培养箱中孵育2h。吸出未贴壁细胞，经离心洗涤后以PRMI-1640培养液重悬（密度2×106/ml），接种于培养瓶，加入重组人IFN-γ 100μg/L及重组人IL-2 500kU/L，第2天加入抗人CD3单抗50μg/L,保持细胞密度（1～2）×106/ml，于第10～11天收集多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）。在剩下的贴壁细胞中加入含重组人GM-CSF（100μg/ L）、重组人IL-4（50μg/L）的RPMI-1640培养基，于37℃，5%CO2的培养箱培养。每3d换液1次，于培养的第5天加入肿瘤裂解物（40μg/ml），于第6天加入重组人TNF-α（500U/ml），培养至第7天即获得抗原致敏的树突状细胞（DC细胞）。将DC及CIK细胞以1∶20比例混合，用含重组人IL-2（250kU/L）的RPMI-1640培养液培养4d，即为DC-CIK细胞。
1.3.3 DC-CIK治疗方案 将经鉴定和质检合格（细菌、真菌培养阴性，细胞活性＞95%）的DC-CIK细胞制成含1%白蛋白及0.9%氯化钠溶液的细胞混悬液，分4次经静脉回输，每疗程回输细胞总数为（5～10）×109个。
1.3.4 RT-PCR检测PBMC TLR4mRNA表达 于DCCIK治疗前1d及治疗后第10天，无菌条件下分别取患者外周血5ml，常规Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，进行紫外定量，并鉴定RNA的质量。按逆转录试剂盒说明书进行逆转录。25μlPCR体系，β-actin为内参。扩增参数：94℃5min；再以94℃40s、50℃40s、72℃90s为1循环，共30个循环；72℃5min。PCR产物在含有goldview的1.5%琼脂糖凝胶上95V恒压电泳35min，最后置于凝胶成像分析仪观察结果，TLR4 mRNA和β-actin均能扩增成功。
1.3.5 ELISA检测脂多糖诱导外周血PBMC释放细胞因子 于DC-CIK治疗前1d及治疗后第10天，无菌条件下分别取患者外周血5ml，常规Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。加入适量含脂多糖（1μg/ml）的RPMI-1640培养液，调整细胞浓度至1×106/ml，加入培养瓶中，置于37℃，5%CO2浓度的培养箱中孵培养24h。取上述细胞悬液，4℃，3 000r/min离心3min，收集上清液。根据ELISA试剂盒说明书检测上清液中IL-6,IL-8,TNF-α水平。
1.3.6 计算机图像处理 RT-PCR用bandscan4.3，对每个目的条带进行总光密度值的分析，以目的产物条带与β-actin产物条带的OD值的比值代表目的基因mRNA表达的相对水平。
1.4 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以表示，治疗前后比较采用配对t检验。
2 结果
2.1DC-CIK治疗前后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA表达 见图1。
由图1可见，DC-CIK治疗后NSCLC患者外周血PBMC TLR4mRNA的表达量（0.43±0.15）低于治疗前的表达量（0.60±0.12），差异具有统计学意义（t=6.272，P＜0.01）。
2.2 DC-CIK治疗前后NSCLC患者IL-6、IL-8、TNF-α水平的比较 见表1。
由表1可见，DC-CIK治疗后NSCLC患者PBMC在脂多糖刺激下IL-6、IL-8及TNF-α分泌显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。
图1 DC-CIK治疗前后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA表达
表1 DC-CIK治疗前后NSCLC患者IL-6、IL-8、TNF-α水平的比较
3 讨论
大量研究表明，恶性肿瘤患者免疫系统（尤其是细胞免疫系统）表现出明显功能障碍，主要包括CD3+CD4+T细胞减少，CD3+CD8+T细胞增多，CD4+/CD8+比例降低，以及NK细胞活性降低[5]，肿瘤患者外周血中有功能的成熟DC细胞数量显著减少，未成熟DC细胞数量聚集[6]。过继细胞免疫治疗能提高患者免疫力，达到治疗和预防肿瘤复发的目的。
CIK细胞是人外周血PBMC加入各种细胞因子共刺激后得到的一群异质细胞，主要效应细胞既表达T细胞标记CD3，又表达NK细胞标记CD56，对肿瘤细胞具有非主要组织相容性复合体（MHC）限制的强大细胞毒反应[7]，在肿瘤的过继免疫治疗中显示出了重大的应用价值。DC是人体功能最强的抗原提呈细胞，由DC与CIK细胞共培养形成的DC-CIK细胞，具有比CIK细胞更强的增殖活性及细胞毒性，并在临床应用中具有更少的不良反应[8]。DC-CIK细胞疗法在临床上已用于甲状腺癌、肺癌、结直肠癌，肝癌等恶性肿瘤，并取得了一定的治疗效果[9]。
Toll样受体（TLRS）属于模式识别受体家族，可以识别多种病原微生物产物及内源性配体[10-11]，其中，TLR4是TLRs家族成员中研究较深入的受体之一。TLR4广泛表达于多种免疫细胞，它介导MyD88依赖性及非依赖性信号途径，从而促进免疫细胞产生IL-6、IL-8及TNF-α等炎性细胞因子[12]。鉴于TLR4在免疫系统中的重要作用，
TLR4与肿瘤免疫的关系已有很多研究，研究表明调节性T细胞的TLR4受体激活可能导致肿瘤免疫抑制[13]，死亡肿瘤细胞释放的高迁移率族蛋白1（HMGB1）和DC细胞表达的TLR4的相互作用是肿瘤细胞免疫抗原交叉递呈所必需的，也可以促进肿瘤细胞毒T细胞特有的反应[14]。但DC-CIK治疗后，NSCLC患者外周血PBMC其表达及功能变化国内外尚未见报道。本研究发现，DC-CIK治疗后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA的表达较治疗前显著降低，在TLR4天然配体脂多糖刺激下，PBMC分泌炎性因子（IL-6、IL-8及TNF-α）显著减少。血清中IL-6细胞因子水平升高与进展期肿瘤患者免疫抑制有关[15]，IL-8是炎症致癌的主要因子之一，与肿瘤的发生、发展密切相关[16]，而TNF-α虽然能直接或介导免疫反应杀伤肿瘤细胞，但如果TNF-α异常增高，会造成肿瘤患者免疫紊乱，使肿瘤细胞逃避宿主免疫监视[17]。这也提示DC-CIK过继免疫治疗可以抑制PBMC的TLR4信号，使TLR4介导的炎症因子产生减少，进而减少慢性炎症及免疫抑制，从而抑制肿瘤的生长和进展。
[1]张晓,杨琼英,林国桢,等.大气污染与居民肺癌发病及死亡灰色关联分析[J].中国公共卫生,2014,30(2):165-170.doi:10.11847/zgggws2014-30-02-12.
[2]Rosenberg S A,Restifo N P,Yang J C,et al.Adoptive cell transfer:a clinical path to effective cancer immunotherapy[J].Nat Rev Cancer,2008,8(4):299-308.doi:10.1038/nrc2355.
[3]李冰,郑秋红.DC-CIK细胞联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌的临床探讨[J].黑龙江医学,2011,35(1):4-7.doi:10.3969/j.issn.1004-5775.2011.01.002.
[4]Takeda K,Akira S.Toll-like receptors in innate immunity[J].Int Immunol,2005,17(1):1-14.
[5]王俞,崔书中.恶性肿瘤患者的免疫功能状态及免疫治疗研究进展[J].中国肿瘤临床,2014,41(13):876-879.doi:10.3969/j.issn. 1000-8179.20131206.
[6]Nefedova Y,Cheng P,Gilkes D,et al.Activation of dendritic cells via inhibition of Jak2/STAT3 signaling[J].J immunol,2005,175(7): 4338-4346.
[7]Schmidt-Wolf I G,Negrin R S,Kiem H P,et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity[J].J Exp Med,1991, 174(1):139-149.
[8]Motohashi S,Nakayama T.Clinical applications of natural killer T cell-based immunotherapy for cancer[J].Cancer Sci,2008,99(4): 638-645.doi:10.1111/j.1349-7006.2008.00730.x.
[9]赵明明,洪珞珈,孙国勋,等.DC-CIK细胞联合治疗158例恶性肿
[10]Akira S,Sato S.Toll-like receptors and their signaling mechanisms[J].Scand J Infect Dis,2003,35(9):555-562.
[11]Beutler B,Hoebe K,Du X,et al.How we detect microbes and respond to them:the Toll-like receptors and their transducers[J]. J Leukoc Biol,2003,74(4):479-485.doi:10.1189/jlb.0203082.
[12]Zanoni I,Ostuni R,Marek L R,et al.CD14 controls the LPS-induced endocytosis of Toll-like receptor 4[J].Cell,2011,147(4): 868-880.doi:10.1016/j.cell.2011.09.051.
[13]Wild C A,Brandau S,Lindemann M,et al.Toll-like Receptors in Regulatory T Cells of Patients With Head and Neck Cancer[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2010,136(12):1253-1259. doi:10.1001/archoto.2010.195.
[14]Apetoh L,Ghiringhelli F,Tesniere A,et al.The interaction between HMGB1 and TLR4 dictates the outcome of anticancer chemotherapy and radiotherapy[J].Immunol Rev,2007,220: 47-59.doi:10.1111/j.1600-065X.2007.00573.x.
[15]Wojciechowska-Lacka A,Matecka-Nowak M,Adamiak E,et al. Serum levels of interleukin-10 and interleukin-6 in patients with lung cancer[J].Neoplasma,1996,43(3):155-158.
[16]朱宝,袁航,奚惠芳,等.幽门螺杆菌感染性胃炎患者胃黏膜组织CagA表达与其培养液中IL-6、IL-8及CRP水平的变化[J].中华医院感染学杂志,2011,21(2):236-238.
[17]Terlikowski S J.Tumour necrosis factor and cancer treatment:a historical review and perspectives[J].Rocz Akad Med Bialymst, 2001,46:5-18.
Changes of TLR4 mRNA expression in peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer after DC-CIK immunotherapy
Objective To investigate the changes of TLR4 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cell (PBMC)of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)after DC-CIK immunotherapy.Methods The mRNA expression of TLR4 in PBMC was detected by reverse transcription PCR(PT-PCR)in 50 patients with NSCLC before and after DC-CIK therapy.The secretion of cytokines(IL-6,IL-8 and TNF-α)of PBMC stimulated with LPS was detected by ELISA before and after DC-CIK therapy. Results After DC-CIK treatment,the relative expression level of TLR4 mRNA in PBMC of NSCLC patients was significantly decreased(t=6.272,P＜0.01),the secretion of IL-6(t=17.407,P＜0.01),IL-8(t=15.244,P＜0.01)and TNF-α (t=12.428,P＜0.01)by PBMC stimulated with LPS was significantly decreased. Conclusion DC-CIK immunotherapy can down-regulate TLR4 expression in PBMC of NSCL patients to enhance the anti-tumor immunity.
Dendritic cells(DC) Cytokine-induced killer(CIK) Non-small cell lung cancer TLR4
��免疫疗效观察[J].哈尔滨医科大学学报,2013,47(1):60-66.
10.3969/j.issn.1000-1905.2013.01.016.
2015-11-24）
（本文编辑：杨丽）
