NF⁃κB/p65 siRNA对小鼠Lewis肺癌移植瘤细胞凋亡和Bax表达的影响

曲耘，吴荣，张晓晔

（中国医科大学附属盛京医院1.第二肿瘤科；2.第四肿瘤科，沈阳 110004）

NF⁃κB/p65 siRNA对小鼠Lewis肺癌移植瘤细胞凋亡和Bax表达的影响

曲耘1，吴荣1，张晓晔2

（中国医科大学附属盛京医院1.第二肿瘤科；2.第四肿瘤科，沈阳 110004）

目的 研究p65siRNA抑制NF⁃κB/p65信号通路对小鼠Lewis肺癌移植瘤细胞凋亡和Bax表达的影响。方法 采用Lewis肺癌细胞C57BL/6雄性小鼠移植瘤组织悬液，建立C57BL/6雄性小鼠移植瘤模型。将NF⁃κB/p65 siRNA接种于荷瘤小鼠，观察下调NF⁃κB/p65表达后荷瘤小鼠瘤细胞凋亡情况。进一步应用实时定量PCR和Western blotting检测肿瘤组织中BaxmRNA及蛋白表达变化。结果 经p65 siRNA治疗后，小鼠肿瘤细胞发生明显凋亡，肿瘤组织BaxmRNA及蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论 NF⁃κB/p65通路可能在Lewis肺癌细胞凋亡中发挥重要作用。

NF⁃κB/p65；Lewis肺癌；凋亡；siRNA；移植瘤；Bax

随着大气污染的日趋严重，肺癌已成为肿瘤中的头号杀手，严重威胁人类健康。传统的放化疗已经不能满足中晚期肺癌患者的需求，人们迫切地希望找到更加行之有效的肺癌治疗方法。肺癌的分子靶向治疗因具有特异性强、不良反应小的优点，获得了高度广泛的关注。

核因子κB（nuclear factor kappaB，NF⁃κB）是由Rel/NF⁃κB家族的多肽成员所形成的一组二聚体形式的转录因子的统称，首次被确认于1986年［1］。NF⁃κB以同源或异源二聚体的形式存在于大多数细胞的胞质中，常见的形式是由p50和p65组成的异源二聚体，其中，p65是其活性部分，与造血过程、炎症反应、免疫反应、细胞增殖与凋亡等多种细胞功能有关。NF⁃κB在肿瘤的发生、发展中意义重大，其传导通路通过调控Bax等多种下游凋亡基因控制肿瘤细胞的凋亡［1⁃2］。研究［3⁃5］显示，NF⁃κB信号通路在许多肿瘤的发生发展中具有重要作用。已有研究［6⁃7］报道，p65与肺癌病理类型相关。以NF⁃κB为靶点的新药开发有望成为肺癌靶向治疗新的探索方向［8⁃9］。

siRNA技术是通过内源性或外源性双链RNA特异性诱发同源mRNA沉默，进而抑制其相应基因的表达，从而阻断该基因的生理或病理作用。该技术为癌症的靶向药研制和临床治疗奠定了基础。

本研究拟通过体外建立裸鼠移植瘤模型并给予其p65 siRNA腹腔注射，检测小鼠瘤细胞凋亡情况及Bax的表达，旨在探讨Bax与p65的关系，阐述Bax在肺癌凋亡中的作用，为靶向药的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

复苏冻存的Lewis细胞（北京金紫晶公司）。将复苏后的细胞在含有10%胎牛血清（美国Hyclone公司）、100 U/mL青霉素和100 pg/mL链霉素的DMEM培养液（美国Gibco公司）中培养，培养条件为37℃、相对饱和湿度、CO2体积分数为5%。取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2 Lewis肺癌小鼠移植瘤模型的建立及分组

雄性健康清洁级C57BL/6小鼠18只（中国医科大学实验动物中心），6～8周龄，体质量200 g。取3只小鼠，在每只小鼠右前肢腋下皮下注射Lewis肺癌细胞悬液0.5 mL（细胞数约为1×107）。2周后，小鼠右前肢腋下均形成皮下瘤。将小鼠脱颈椎处死，无菌取出瘤组织，用生理盐水进行研磨，离心，制成细胞悬液。在另外15只小鼠右前肢腋下皮下注射Lewis肺癌细胞悬液0.2 mL（细胞数约为5×106），1周后开始治疗。将小鼠随机分成3组，每组5只。（1）PBS对照组：每隔1 d给予小鼠腹腔注射PBS；（2）对照siRNA组：每隔1 d给予小鼠腹腔注射无关对照siRNA（终浓度为100 nmol/L）；（3）p65 siRNA组：每隔1 d给予小鼠腹腔注射p65 siRNA（终浓度为100 nmol/L）。2周后，将小鼠脱颈椎处死，取出瘤组织进行检测。

1.3 细胞凋亡的TUNEL原位检测

固定瘤组织，修块，脱水，透蜡，包埋。用切片机切制5 μm的石蜡标本薄片，并制成切片。按照TUNEL检测试剂盒（中国天根生化科技有限公司）说明书，检测切片瘤组织中的细胞凋亡情况。随机在每张切片上选取5个高倍视野（×200），计数500个细胞中的阳性细胞数。细胞核内见棕黄色颗粒的细胞为TUNELFH性细胞。

1.4 实时定量PCR法分析BaxmRNA表达水平

按照总RNA提取试剂盒（中国天根生化科技有限公司）说明书提取总RNA。用TIANScript RT Kit（TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，中国天根生化科技有限公司）进行反转录，获得用于PCR反应的对应的cDNA。

实时定量PCR反应体系：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L，上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1）各0.5 μL，SYBR GREEN mas⁃termix 10 μL，加ddH2O至20 μL。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共40个循环；最后1个循环结束后，4℃放置5 min以终止反应。本研究采用韩国BI⁃ONEER公司生产的ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。

表1 实时定量PCR引物序列Tab.1 Oligonucleotide primer sets for real⁃time PCR

1.5 Western blotting印迹法检测蛋白表达

将100 μL RIPA裂解液加入20 mg肿瘤组织中，于冰上制成匀浆，4℃下12 000 r/min离心10 min，分离上清，检测蛋白浓度。采用10%SDS⁃PAGE电泳分离蛋白，上样量为40 μg，上样体积为20 μL。电泳后制备“三明治”，经过转印将蛋白电转移至PVDF膜上。以5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入1∶400稀释的抗p65一抗（美国Santa Cruz公司）和1∶1 000稀释的抗Bax一抗（美国Santa Cruz公司），经过洗膜，再加入1∶5 000稀释的p65和Bax的二抗（美国Santa Cruz公司），37℃下反应60 min，暗室内曝光。采用Gene Tools软件分析目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。每个实验均重复3次，实验结果用表示。采用单因素方差分析进行多个样本间均数比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p65 siRNA对小鼠移植瘤细胞凋亡的影响

TUNEL检测结果表明，p65 siRNA组细胞凋亡数（271±11）明显高于PBS对照组（45±5）和对照siRNA组（38±4），差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。提示p65 siRNA能够促进小鼠移植瘤细胞凋亡。

2.2 p65 siRNA对小鼠移植瘤中Bax表达的影响

RT⁃PCR结果显示，p65 siRNA组BaxmRNA的表达明显高于PBS对照组和对照siRNA组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2C。

Western blotting结果显示，与PBS对照组和对照siRNA组相比，p65 siRNA组中Bax蛋白的表达均明显上调，见图2A、2B。

图1 NF⁃κB/p65 siRNA对小鼠移植瘤细胞凋亡的影响 DAB×400Fig.1 Effects of NF⁃κB/p65 siRNA on apoptosis of tumor cells in xenografted nude mice DAB×400

图2 NF⁃κB/p65 siRNA对小鼠移植瘤细胞Bax表达的影响Fig.2 Effects of NF⁃κB/p65 siRNA on Bax expressions in nude mice Lewis tumor cells xenografts

3 讨论

肺癌发病率在世界范围内逐年上升，为全球癌症致死的最常见原因之一。许多患者在就诊时已属晚期，进一步探究肺癌细胞凋亡的分子机制，对肺癌的系统治疗具有深刻的意义。研究［8⁃12］表明，Bax在细胞凋亡中发挥着重要的作用。细胞DNA损伤后，p53基因表达增强，由于p53对Bax有正调控作用，Bax也随之表达增强。Bax在线粒体膜上与膜共同形成渗透性膜转移孔复合物，间接激活Caspase⁃3，诱导细胞凋亡［13⁃15］。NF⁃κB常见的存在形式是由p50和P65组成的异源二聚体［16］。NF⁃κB传导通路通过调控包括Bax在内的多种下游凋亡基因来控制肿瘤细胞的凋亡。

本研究探讨了NF⁃κB/p65通路在Lewis肺癌中对凋亡的影响及其对Bax表达水平的影响。本研究首先建立了Lewis肺癌C57BL/6小鼠移植瘤模型，然后给予移植瘤小鼠p65 siRNA腹腔注射，结果发现Lewis肺癌C57BL/6小鼠移植瘤细胞发生明显凋亡。随后，本研究采用RT⁃PCR和Western blotting检测了BaxmRNA及蛋白表达水平的变化情况，结果显示，p65 siRNA组小鼠移植瘤细胞中Bax的表达水平显著高于PBS组和对照siRNA组。表明p65 siRNA能提高Bax的表达水平，促进移植瘤细胞凋亡，推断p65 siRNA对NF⁃κB/p65通路具有很强的抑制作用。

综上所述，本研究结果初步显示，p65 siRNA在体内能显著促进Lewis肺癌细胞的凋亡，明显上调Bax的表达，提示NF⁃κB信号途径在C57BL/6小鼠Lewis肺癌的发生、发展中发挥着极其重要的作用，NF⁃κB/p65可能成为未来肺癌治疗的分子靶点。

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（编辑 王又冬）

Effects of NF⁃κB/p65 siRNA on Apoptosis and Bax Expression in Lung Tumour Cell Xenografts of Nude Mouse

QU Yun1，WU Rong1，ZHANG Xiaoye2
（1.The Second Department of Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.The Forth Department of Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the effects of nuclear factor⁃kappaB（NF⁃κB）/p65 signaling transduction on the apoptosis and expressions of apoptosis⁃related genesBaxin nude mouse lung tumour cell xenografts.Methods The nude mice Lewis lung carcinoma cell xenograft model was established，and then the mice were intraperitoneally injected with NF⁃κB/p65 small interfering RNA（siRNA）.The apoptosis of xenografted tumor cells in nude mice was detected by TUNEL assay.Expressions ofBaxmRNA and protein were detected by RT⁃PCR and Western blotting. Results The result of TUNEL assay demonstrated that p65 siRNA evidently evoked cell apoptosis.Compared to the PBS treatment group or the normal control mice，both mRNA and protein expression levels of Bax in tumor xenografts were significantly up⁃regulated.There were significant differences among three groups（P＜0.05）.Conclusion NF⁃κB/p65 subunit may play an essential role in cell apoptosis of Lewis lung tumor.

NF⁃κB/p65；Lewis lung cancer；apoptosis；small interfering RNA；xenografts；Bax

R363.2

A

0258-4646（2017）02-0145-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.02.011

曲耘（1968-），女，主治医师，博士.

张晓晔，E-mail：Xiaoyezhangcn@163.com

2016-06-06

网络出版时间：