褪黑素通过下调细胞周期蛋白及其激酶的表达抑制人骨肉瘤MG⁃63细胞增殖

刘立峰，潘玉涛，陈涤，李侠，刘养洲，普星宇，李增春

（同济大学附属东方医院创伤骨科，上海 200120）

褪黑素通过下调细胞周期蛋白及其激酶的表达抑制人骨肉瘤MG⁃63细胞增殖

刘立峰，潘玉涛，陈涤，李侠，刘养洲，普星宇，李增春

（同济大学附属东方医院创伤骨科，上海 200120）

目的 探讨高浓度褪黑素抑制人骨肉瘤细胞系MG⁃63细胞增殖的潜在机制。方法 在体外培养的MG⁃63细胞中，外源性加入4 mmol/L浓度褪黑素，分别用Western blotting和实时PCR方法检测高浓度褪黑素对细胞周期蛋白（cyclins）及其依赖性激酶（CDK）蛋白和mRNA水平表达的影响。结果 Western blotting和实时PCR检测结果显示，4 mmol/L浓度的褪黑素以时间依赖性方式显著地下调了与细胞周期G1期进展有关的cyclin D1和CDK4蛋白和mRNA表达水平，与细胞周期G2/M期进展有关的cyclin B1和CDK1蛋白和mRNA表达水平，但与G1/S期转变和S期进展有关的cyclin E、CDK2和cyclin A蛋白和mRNA表达水平没有变化。结论 褪黑素以时间依赖性方式，通过诱导细胞周期停滞抑制骨肉瘤MG⁃63细胞增殖，这种抑制效应与cyclin D1和CDK4及cyclin B1和CDK1的表达下调有关。

褪黑素；骨肉瘤；细胞周期蛋白；细胞周期蛋白依赖性激酶

骨肉瘤是一种最常见的原发恶性骨肿瘤，好发于青少年的长骨干骺端，尤以股骨下段和胫骨上段多见，由间叶组织产生的骨样组织和未分化的骨组织组成；骨肉瘤是12～18岁青少年中除白血病和淋巴瘤外，第3种最常见的肿瘤疾病［1］。据报道［1］，新辅助化疗的引入使骨肉瘤的生存率得到了显著提高，但不良反应的增加也越来越受到人们关注。因此，如果一种药物既能具有抗肿瘤特性，又能减少化疗药物的副反应，将具有极好的应用前景。

褪黑素是一种主要由松果体合成分泌的激素，视网膜、胃肠道和骨髓也能合成［2］，对骨生长有影响的骨髓细胞也可以从头合成褪黑素［3］。褪黑素已经在许多肿瘤细胞中被发现具有抗肿瘤效应［4］，包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、葡萄膜黑色素瘤、前列腺癌、肠癌和肝癌等。1个随机对照的meta分析［5］指出，褪黑素作为一种辅助治疗，可以明显延缓肿瘤的进展、提高1年生存率和减缓放化疗所引起的副反应。骨的代谢与体内褪黑素水平密切相关［6］，研究［7］发现，高浓度褪黑素可显著地抑制人骨肉瘤MG⁃63细胞的增殖，但其机制不明。

本研究的目的是检测高浓度褪黑素抑制人骨肉瘤MG⁃63细胞增殖的潜在机制，为更好地应用褪黑素辅助治疗骨肉瘤等疾病提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人类的骨肉瘤MG⁃63细胞系被培育在添加10%胎牛血清（HyClone公司）的DMEM培养基（Gibco公司）中，在5%CO2和37℃的条件下培养，每隔1 d更换1次培养基。MG⁃63细胞以1×104/cm2的密度接种到培养皿中，24 h后用于后续实验。褪黑素的母液用含有100%的DMSO（Sigma公司）制备，随后根据待检测的浓度用培养基做1个梯度稀释；在最后检测时，保证对照组和实验组的培养基中含有相同浓度的0.2%DMSO和10%胎牛血清。褪黑素购自Sig⁃ma公司，β⁃actin和单克隆的细胞周期蛋白（cyclin A）、cyclin B1、cyclin D1、cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin⁃dependent kinase，CDK）1、CDK2和CDK4抗体购自Cell Signaling Technology公司，实时PCR检测试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting：将MG⁃63细胞接种到10 cm培养皿上，24 h后培养基被换成含有4 mmol/L浓度褪黑素的培养基（对照组换成含有0.2%DMSO的培养基），再分别培养4 h、24 h和48 h。然后在4℃条件下用裂解液（含有150 mmol/L NaCl，1%NP⁃40，0.1%SDS，2 μg/mL抑肽酶，1 mmol/L PMSF）裂解细胞30 min，在4°C条件下，以12 000g离心上清液15 min。取50 μg总蛋白，利用12%SDS⁃PAGE电泳分离蛋白，在低温、2 h、60 V或40 V的条件下将蛋白转到PVDF膜上，在含有5%脱脂牛奶的封闭液中浸泡膜2 h。加入单克隆抗体（以1∶200或1∶500比例稀释），4℃条件下过夜，检测相关蛋白的表达情况，然后加入过氧化物酶抗小鼠或抗兔的IgG（以1∶6 000或1∶8 000比例稀释），在室温的条件下反应2 h。利用EC3成像系统（UVP公司）检测特异性条带表达，用Gel⁃Pro Analyzer 4.0软件（Media Cybernetics公司）测量每个条带的OD值，计算出每个样本的目的蛋白和内参蛋白的比率。

1.2.2 实时PCR：将MG⁃63细胞接种到6 cm培养皿上，24 h后培养基被换成含有4 mmol/L浓度褪黑素的培养基（对照组换成含有0.2%DMSO的培养基），再分别培养4 h、24 h和48 h。用TRIzol试剂（Invitro⁃gen公司）将RNA从细胞中分离，用逆转录试剂盒（TaKaRa公司）逆转录总RNA。用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（TaKaRa公司）在ABI Prism 7900 HT仪器上进行实时定量PCR检测；在20 μL总反应体系中，95℃、30 s预变性，在95℃、5 s和60℃、30 s条件下退火和延伸，循环40次。引物的序列如表1所示，β⁃actin作为内参。通过分析溶解曲线保证结果的可靠性。根据2-△△CT方法，利用SDS 2.4软件（ABI公司）分析计算实时定量PCR的结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。采用双因素方差分析评价褪黑素的剂量、暴露时间和二者之间的相互作用造成的不同是否有意义，采用Bon⁃ferroni检验进行两两比较。采用单因素方差分析评价各个处理组之间差异。所有的数据用至少3次独立实验的表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高浓度褪黑素对cyclins及CDK蛋白表达水平的影响

在前期研究中，发现4～10 mmol/L褪黑素可以通过诱导人骨肉瘤MG⁃63细胞周期停滞而显著抑制细胞增殖。流式细胞仪分析显示，在细胞暴露于各种浓度的褪黑素24 h以后，与对照组细胞相比，4～10 mmol/L浓度的褪黑素显著地增加了细胞周期中G0/G1期细胞的比例，且同时减少了S期和G2/M期细胞的比例（P均＜0.01）。为了检测4～10 mmol/L浓度褪黑素诱导MG⁃63细胞周期停滞的机制，用West⁃ern blotting方法检测了cyclins及其激酶蛋白表达情况。鉴于4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L和10 mmol/L浓度褪黑素在诱导MG⁃63细胞周期分布上无统计学差异（Bonferroni检验均P＞0.05），故本研究中仅检测4 mmol/L浓度褪黑素对cyclins及其激酶表达的影响。

Western blotting检测显示，4 mmol/L浓度褪黑素以时间依赖性方式显著地下调了与G1期进展有关的cyclin D1和CDK4的蛋白表达水平，与细胞周期G2/M期进展有关的cyclin B1和CDK1的蛋白表达水平，但与G1/S期转变和S期进展有关的cyclin E、CDK2和cyclin A的蛋白表达水平没有变化。见图1。

表1 实时PCR引物序列Tab.1 Primer sequences used in real⁃time PCR

图1 4 mmol/L浓度褪黑素对骨肉瘤MG⁃63细胞的cyclins及CDK蛋白表达水平的影响Fig.1 Effect of 4 mmol/L melatonin on the expressions of cyclins and cyclin⁃dependent kinases at protein levels in MG⁃63 cells

2.2 高浓度褪黑素对cyclins及其激酶mRNA表达水平的影响

为了进一步检测4～10 mmol/L浓度褪黑素诱导MG⁃63细胞周期停滞的机制，用实时PCR方法检测了cyclins及其激酶的mRNA水平表达情况。实时PCR分析显示，4 mmol/L浓度的褪黑素以一种时间依赖性方式显著地下调了与细胞周期G1期进展有关的cyclin D1和CDK4的mRNA表达水平，与细胞周期G2/M期进展有关的cyclin B1和CDK1的mRNA表达水平，与G1/S期转变和S期进展有关的cyclin E、CDK2和cyclin A的mRNA表达水平没有变化。见图2。

3 讨论

图2 4 mmol/L浓度褪黑素对骨肉瘤MG⁃63细胞的cyclins及CDK mRNA水平表达的影响Fig.2 Effect of 4 mmol/L melatonin on the expressions of cyclins and cyclin⁃dependent kinases at mRNA levels in MG⁃63 cells

褪黑素可以在许多生物调节过程中发挥作用，如生物周期节律、睡眠、衰老、生殖、骨生理和肿瘤的生长等；其抗肿瘤机制复杂而广泛，主要包括：调节雌激素信号转导通路，调节生长因子的分泌和释放，干扰钙调蛋白和微管蛋白的功能，增加细胞间缝隙连接，促进细胞凋亡，影响细胞周期，影响细胞代谢和免疫调节作用等［8］。越来越多的证据显示，褪黑素水平的下降与肿瘤的发生、发展和恶化密切相关。

褪黑素还可以缓解化疗药物导致的无力、口腔炎、神经毒性和心脏毒性等不良反应。骨肉瘤的发生与褪黑素水平的减少之间的相关性研究［1⁃2，6，9］表明，体内褪黑素水平的下降可能是引起骨肉瘤发生和发展的原因之一。研究［7］发现，虽然1 nmol/L～2 mmol/L浓度的褪黑素不能有效地抑制骨肉瘤MG⁃63细胞的增殖，但是4～10 mmol/L浓度的褪黑素可以通过诱导细胞周期停滞显著地抑制MG⁃63细胞增殖，为应用褪黑素辅助治疗骨肉瘤开辟了新的道路。本研究进一步阐明了高浓度（4 mmol/L）褪黑素抑制MG⁃63细胞增殖与细胞周期蛋白及其激酶的表达下调有关。

通过诱导细胞周期停滞抑制肿瘤细胞增殖一直是近年肿瘤学研究的热点。许多研究［10⁃13］也指出，一些因子抑制骨肉瘤等细胞生长的效应主要是通过下调cyclin D1等的表达诱导细胞周期停滞实现的。本研究也证实高浓度褪黑素能以时间依赖性方式显著地下调与细胞周期G1期进展有关的cy⁃clin D1蛋白和mRNA表达水平［7］。近年来，关于信号传导通路在骨肉瘤病因学中的作用不断得到阐明［14］，比较热门的有Notch信号通路（骨肉瘤侵袭的启动因素）、Wnt/β⁃catenin（影响成骨细胞分化，与原发性及继发性骨肿瘤均有密切联系）、MAPK信号通路（与骨肉瘤的增殖和侵袭密切相关）、Fas途径（在骨肉瘤肺转移中起重要作用）。因此，深入研究这些途径对骨肉瘤的诊断、治疗和预后评估方面具有重要的潜在价值。骨肉瘤转移过程中某些分子生物学的改变可能和化疗抵抗有关，针对这些分子生物学改变进行治疗有可能提高治疗骨肉瘤的疗效。褪黑素通过下调cyclin D1等的表达诱导细胞周期停滞是否与上述途径有关，还是有其他途径参与了这个过程，目前还不清楚，同样值得进一步研究证实。

［1］FRIEBELE JC，PECK J，PAN X，et al.Osteosarcoma：a meta⁃analy⁃sis and review of the literature［J］.Am J Orthop，2015，44（12）：547-553.

［2］STEHLE JH，SAADE A，RAWASHDEH O，et al.A survey of molec⁃ular details in the human pineal gland in the light of phylogeny，structure，function and chronobiological diseases［J］.J Pineal Res，2011，51（1）：17-43.DOI：10.1111/j.1600⁃079X.2011.00856.x.

［3］CONTI A，CONCONI S，HERTENS E，et al.Evidence for melatonin synthesis in mouse and human bone marrow cells［J］.J Pineal Res，2000，28（4）：193-202.

［4］ZAMFI CHIRU AA，POPESCU CR，GHEORGHE DC.Melatonin and cancer［J］.J Med Life，2014，7（3）：373-374.

［5］WANG YM，JIN BZ，AI F，et al.The efficacy and safety of melato⁃nin in concurrent chemotherapy or radiotherapy for solid tumors：a

Melatonin Inhibits the Proliferation of Human MG⁃63 Osteosarcoma Cells via Downregulation of Cyclins and CDKs

LIU Lifeng，PAN Yutao，CHEN Di，LI Xia，LIU Yangzhou，PU Xingyu，LI Zengchun
（Department of Trauma Orthopaedics，Shanghai East Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai 200120，China）

Objective To investigate the potential mechanism that melatonin at higher concentrations inhibits the proliferation of human MG⁃63 osteosarcoma cells，so as to provide a certain experimental basis for the better application of melatonin in the treatment of diseases in Department of Orthopedics.Methods MG⁃63 cells cultured in vitro were treated with melatonin at a concentration of 4 mmol/L.Western blotting and real⁃time PCR method were used to analyze the effect of melatonin on the expression of cyclins and CDKs at protein and mRNA levels，respectively.Results Western blotting and real⁃time PCR analyses showed that melatonin’s inhibitory effect was possibly through the downregulation of cyclin D1 and CDK4 that related to the G1phase，and downregulation of cyclin B1 and CDK1 that related to the G2/M phase.However，there was no obvious dif⁃ference of cyclin E，CDK2，and cyclin A，which were related to G1/S transition and S phase.Conclusion Melatonin may significantly inhibit hu⁃man osteosarcoma cell proliferation by inducing cell cycle arrest in a time⁃dependent manner，which is related to the downregulation of cyclin D1，CDK4，cyclin B1 and CDK1.

melatonin；osteosarcoma；cyclins；cyclin⁃dependent kinase

R816.8

A

0258-4646（2017）02-0131-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.02.008

上海市浦东新区卫生系统优秀青年医学人才培养（PWRq2013⁃15）；上海市卫生局面上项目（20134212）；同济大学青年优秀人才培养行动计划（1507219028）

刘立峰（1978-），男，讲师，博士.

李增春，E-mail：drlizc@163.com

2016-07-25

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