结直肠癌患者癌组织中SPY1蛋白表达变化及意义

刘贤称,张青,冯佳,靳钦,张曙

(南通大学附属医院，江苏南通226001)

结直肠癌患者癌组织中SPY1蛋白表达变化及意义

刘贤称,张青,冯佳,靳钦,张曙

(南通大学附属医院，江苏南通226001)

目的 观察SPY1蛋白在结直肠癌患者癌组织中的表达变化并探讨其意义。方法 收集169例结直肠癌石蜡包埋标本，运用Western blotting及免疫组化Envision法检测SPY1蛋白表达情况，结合临床病理特征和随访资料进行统计学分析。结果 SPY1蛋白阳性表达于结直肠癌组织的细胞核，呈棕黄色或棕褐色点状，低或无表达84例(49.70%)，高表达85例(50.30%)。SPY1蛋白在结直肠癌组织中的表达与TNM分期、肿瘤浸润深度及术前血清癌胚抗原(CEA)值有关(P均<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度、淋巴结转移无关(P均>0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示SPY1高表达者比低表达者5年生存率低。Log-Rank检验行单因素生存分析显示SPY1表达程度、肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及术前血CEA值与术后生存时间有关(P均<0.05)，而患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤组织学类型与术后生存无关(P均>0.05)。COX比例风险回归模型多因素分析显示SPY1表达程度、肿瘤分化程度、TNM分期及术前血CEA值为预后的独立危险因素(P均<0.05)。结论 SPY1蛋白在结直肠癌组织中呈高表达，其与患者TNM分期、肿瘤浸润深度及术前血CEA值密切相关，检测其水平有助于患者预后判断。

结直肠癌；SPY1蛋白；免疫组织化学

结直肠癌(CRC)是全球常见的恶性肿瘤之一，约有近25%的CRC患者会出现远处转移[1]。近年来，随着精准医疗概念的提出，尤其是新的靶向药物引进，CRC患者5年生存率有所上升，但总存活率仍不乐观[2，3]。因此，有必要探索更多CRC特定的预后靶点来对患者进行评估，为进一步的靶向治疗提供理论依据。人类Speedy A1(SPY1)是Speedy/RINGO家族中的一员，是细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDKs)的活化分子，可活化CDK2促进细胞增殖[4]。目前，国内尚无关于SPY1表达与CRC预后关系的研究。2009年1月～2010年12月，我们通过检测SPY1蛋白在CRC组织和癌旁正常组织中的表达情况，分析其表达与CRC各临床病理特征及预后间的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集南通大学附属医院病理科2009～2010年169例CRC患者癌组织石蜡标本及其相对应的癌旁组织(距离癌组织5 cm)标本。其中男108例、女61例，年龄45～75岁，平均60岁。结肠癌124例，直肠癌45例；组织学类型包括管状腺癌和乳头状腺癌151例，混合型(管状和黏液)腺癌6例，黏液腺癌8例，印戒细胞癌2例，腺鳞癌2例；组织分化程度：低分化15例，高、中分化154例；根据AJCC第7版结肠直肠癌TNM分期标准进行分期：0～Ⅰ期31例，Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期72例。所有标本患者术前未经任何放化疗或免疫治疗。所有病例有相应的临床资料及随访记录，随访率100%，随访截至2015年6月，最长生存时间为62个月，最短为3个月。

1.2 SPY1蛋白表达测定 CRC肿瘤组织标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，常规脱蜡水化，微波处理及EDTA抗原修复，免疫组化Envision法行SPY1标记。鼠抗人SPY1单克隆抗体购自上海圣克鲁斯生物技术有限公司。用自身对照作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。两位高年资病理医师对免疫组化切片染色结果进行双盲法分析。SPY1免疫组化染色阳性结果为肿瘤细胞核呈棕黄色或棕褐色点状。结果判读参照文献[5]：高倍镜下(×400)分别对每个位点计数100个细胞，每例共计400个，按要求分别记录染色强度及阳性细胞百分比。阳性细胞染色强度分值如下：0分为无着色，1分为黄色弱阳性，2分为浅棕色中阳性，3分为棕褐色强阳性；阳性细胞百分比根据四类计分：0分(阴性)，1分(1%～33%)，2分(34%～66%)，3分(≥67%)；两者之和的结果作为SPY1染色的最终评分：0～3分为无或低表达，4～6分为高表达。Western blotting法:取-80 ℃冰箱保存的30例新鲜组织，蛋白质裂解后由10%～15%的SDS-PAGE凝胶分离，湿转法将胶上的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭2 h，室温1 h，4 ℃过夜的条件下用5%脱脂奶粉的TBST稀释一抗孵育转印膜(SPY1 1∶500；GAPDH 1∶1 000)温育，洗膜后加二抗温育。同体积混合Luminol Ecl Reagent A和B液，加入膜上，并于室温1 min孵育；在暗室内显影和定影。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。CRC肿瘤组织与癌旁正常组织中SPY1蛋白表达差异分析及SPY1蛋白表达与各临床病理特征间的关系分析采用Pearson卡方检验；SPY1蛋白表达与CRC患者生存期关系分析采用Kaplan-Meier生存分析；单个临床病理特征与CRC患者生存期的分析采用Log-Rank单因素生存分析；有统计学意义的各临床病理特征间的多因素分析采用COX比例风险回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPY1蛋白在CRC组织中的表达及其与CRC患者临床病理特征的关系 SPY1蛋白阳性表达于CRC肿瘤组织的细胞核，呈棕黄色或棕褐色点状，低或无表达84(49.70%)例，高表达85(50.30%)例，而150例癌旁组织不表达。SPY1蛋白在CRC组织中的表达与TNM分期(χ2=9.111，P=0.011)、肿瘤浸润深度(χ2=7.482，P=0.006)及术前血CEA值(χ2=13.988，P<0.001)有关，而与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度、淋巴结转移无关(P均>0.05)，见表1。Western blotting结果显示，27例(90%)CRC组织中SPY1蛋白表达高于相应癌旁组织。

表1 SPY1蛋白表达与CRC患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.2 预后分析 Kaplan-Meier生存曲线显示SPY1高表达组比低表达组5年生存率低(P<0.05)。Log-Rank检验行单因素生存分析显示SPY1表达程度(P<0.001)、肿瘤分化程度(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、肿瘤浸润深度(P=0.001)、淋巴结转移(P<0.001)及术前血CEA值(P<0.001)与术后生存时间有关，而患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤组织学类型与术后生存无关(P均>0.05)。COX比例风险回归模型多因素分析进一步显示SPY1表达程度(P=0.034)、肿瘤分化程度(P=0.002)、TNM分期(P=0.003)及术前血CEA值(P=0.003)为预后的独立危险因素。

3 讨论

CRC的发生发展及转移是多因素作用的结果，而清楚认识其某些重要的分子生物学机制对于CRC的早期检测、早期诊断及靶向治疗有重要意义[6～8]。SPY1是一种细胞周期调节蛋白，可参与多种肿瘤的发生与发展，包括卵巢癌、神经母细胞瘤、胶质瘤等[9～11]。SPY1可参与乳腺浸润性导管癌的发生及发展[12]；在非霍奇金淋巴瘤中SPY1亦被认为可通过调节p27的磷酸化水平介导淋巴瘤细胞的增殖[13]；在肝癌中SPY1可作为细胞周期调节基因促进肝癌细胞的增殖和存活[14,15]；而在大脑胶质瘤中SPY1可与CLIPR-59相互作用，抑制CLIPR-59与CLYD的结合，阻碍RIP1的去泛素化，从而介导胶质瘤细胞对TNF-α诱导凋亡的抗性[16,17]。以上研究成果证实SPY1是一种重要的癌基因。

本研究结果表明，SPY1蛋白表达与TNM分期、肿瘤浸润深度及术前血CEA值有关。提示SPY1蛋白过表达对CRC肿瘤细胞的浸润和侵袭能力起到一定程度的促进作用，其可能参与CRC的恶性进展过程。本研究还对169例CRC患者的随访资料进行分析，发现SPY1高表达者5年生存时间明显低于低表达者，表明SPY1高表达可增加CRC患者的死亡风险。

总之，SPY1可作为一种促癌因子参与CRC的发生发展及预后，可能成为CRC新的分子治疗靶点，通过靶向药物阻断CRC中SPY1蛋白的表达，有可能抑制CRC的发生发展。同时，SPY1蛋白高表达提示CRC预后不良，可作为判断CRC预后的独立因子。

[1] Bartlettt DL, Chu E. Can metastatic colorectal cancer be cured[J]. Oncology, 2012,26(3):266-275.

[2] Huang CW, Tsai HL, Chen YT, et al. The prognostic values of EGFR expression and KRAS mutation in patients with synchronous or metachronous metastatic colorectal cancer[J]. BMC Cancer, 2013,13(1):599.

[3] Chen C, Wang L, Liao Q, et al. Hypermethylation of EDNRB promoter contributes to the risk of colorectal cancer[J]. Diagnostic pathology, 2013,8(1):199.

[4]Cheng A, Xiong W, Ferrell JE Jr, et al. Identification and comparative analysis of multiple mammalian Speedy/Ringo proteins[J]. Cell Cycle, 2005,4(1):155-165.

[5] Huang J, Zhang X, Tang Q, et al. Prognostic significance and potential therapeutic target of VEGFR2 in hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Pathol, 2011,64(4):343-348.

[6] Grady WM, Pritchard CC. Molecular alterations and biomarkers in colorectal cancer[J]. Toxicol Pathol, 2014,42(1):124-139.

[7] Wiedenbein L, Kristiansen M, Adamsen L， et al. Assessment of rehabilitation needs in colorectal cancer treatment: Results from a mixed audit and qualitative study in Denmark[J]. Acta Oncol， 2016,55(6):705-711.

[8] Abdelsattar ZM, Wong SL, Regenbogen SE, et al. Colorectal cancer outcomes and treatment patterns in patients too young for average-risk screening[J]. Cancer, 2016,122(6):929-934.

[9] Lu S, Liu R, Su M, et al. Spy1 participates in the proliferation and apoptosis of epithelial ovarian cancer[J]. J Mol Histol, 2016,47(1):47-57.

[10] Parry PV, Engh JA. The cyclin-like protein Spy1 regulates growth and division characteristics of the CD133+population in human glioma[J]. Neurosurgery, 2014,74(6):N18-19.

[11] Podkowa M, Irwin MS. Spy'ing on differentiation in neuroblastoma[J]. Oncotarget, 2014,5(15):5848-5849.

[12] Zucchi I, Mento E, Kuznetsov VA, et al. Gene expression profiles of epithelial cells microscopically isolated from a breast-invasive ductal carcinoma and a nodal metastasis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(52):18147-18152.

[13] Hang Q, Fei M, Hou S, et al. Expression of Spy1 protein in human non-Hodgkin's lymphomas is correlated with phosphorylation of p27 Kip1 on Thr187 and cell proliferation[J]. Med Oncol, 2012,29(5):3504-3514.

[14] Ke Q, Ji J, Cheng C, et al. Expression and prognostic role of Spy1 as a novel cell cycle protein in hepatocellular carcinoma[J]. Exp Mol Pathol, 2009,87(3):167-172.

[15] 柯靖，柯青，陆牡丹，等.肝细胞肝癌中SPY1蛋白的表达及其临床意义[J].江苏医药，2009，35(5)：516-518.

[16] Ding Z, Liu Y, Yao L, et al. Spy1 induces de-ubiquitinating of RIP1 arrest and confers glioblastoma's resistance to tumor necrosis factor (TNF-alpha)-induced apoptosis through suppressing the association of CLIPR-59 and CYLD[J]. Cell Cycle, 2015,14(13):2149-2159.

[17] Tewari R, Choudhury SR, Ghosh S, et al. Involvement of TNFalpha-induced TLR4-NF-kappaB and TLR4-HIF-1alpha feed-forward loops in the regulation of inflammatory responses in glioma[J]. J Mol Med (Berl), 2012,90(1):67-80.

张曙(E-mail:tdfyzs@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.022

R735.3

B

1002-266X(2017)09-0066-03

2016-11-14)