HPLC—RID测定咽炎清片中左旋龙脑含量

赵俊杰　钱一鑫　康冀川　何珺

摘要：以左旋龙脑标准品为对照，应用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）（条件：Neptune C-18色谱柱，甲醇-04%磷酸（65∶35）为流动相，流速08mL/min，柱温25℃）对咽炎清片中左旋龙脑的含量进行测定，结果发现左旋龙脑在10～100μg/mL范围内呈现良好的线性关系，其回归方程为Y=13687X-21173（r=09997，n=6），加样回收率为1033%，RSD为042%，同时该方法操作简便，分析快速，方法学考察结果符合有关新药研究的技术要求及《中国药典》2015年版第四部通则中对于高效液相色谱法的各项规定，适宜用于咽炎清片中左旋龙脑含量测定。

关键词：示差检测器；咽炎清；左旋龙脑；高效液相色谱

中图分类号：R917；O6577

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2017）02-0074-04国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.016

Abstract：The concentration of L-borneol in Yanyanqing Tablet was determined by High Performance Liquid Chromatography （HPLC） （Conditions： C-18 Neptune column， methanol -04% phosphoric acid （65∶35） as the mobile phase， flow rate 08mL/min， column temperature 25℃）. The results showed that the concentration of L-borneol had a good linear relationship within the range of 10-100μg/mL. The regression equation was Y=13687X-21173 （r=09997， n=6）. The average recovery was 1033%， while RSD was 042%. It is an easy and fast approach that meet the requirements for developing new drug， as well as Chinese Pharmacopoeia 2015 （the fourth volume）， by methodological study. The method is suitable for determining the concentration of L-borneol in Yanyanqing Tablet.

Key words：refractive index detector； Yanyanqing tablet； L-borneol； HPLC

示差检测器（Refractive index detector， RID）是目前HPLC法中常用的一种检测器，它可与输液泵、色谱柱、进样器等组成凝胶渗透色谱仪或高速液相色谱仪系统，也可以配置适当的进样系统作为单独的分析仪器使用，同时对所有溶质都有响应。某些不能用選择性检测器检测的组分，可用示差检测器检测。由于不同的液体折光不同，因此该检测器通用性强，可广泛地应用于化工、石油、医药、食品等领域。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比[1]。

咽炎清片为贵州苗族药验方，是由肿节风、左旋龙脑和薄荷脑3味组成，味甜，微涩；对于口疮（复发性口疮、疱疹性口炎）、喉痹（急慢性咽炎）、牙周炎等具有清热解毒，消肿止痛的作用[2]，其质量标准收载于《国家中成药标准汇编》口腔肿瘤儿科分册。其中左旋龙脑是由菊科艾纳香属植物艾纳香Blumea balsamifera（L）DC的叶和嫩枝中提取制得，为挥发性物质，具有开窍醒神、清热止痛等功效；可用于热病神昏、痉厥、中风痰厥、气郁暴厥、中恶昏迷、目赤、口疮、咽喉肿痛和耳道流脓等的治疗[3]。目前，咽炎清片质量标准中只针对肿节风这一味药材进行了质量控制，而挥发性物质左旋龙脑的含量测定主要为气相色谱法或气质联用[4-6]，因此本文参考相关文献，采用HPLC-RID法测定了咽炎清片中左旋龙脑的含量，分离度较好，简便易行，适合于咽炎清片中左旋龙脑的定性、定量分析，为有效控制咽炎清片的质量提供参考依据。

1仪器、药品与试剂

Agilent-1100型高效液相色谱仪；Neptune C-18（5μm，46mm×150mm）高效液相色谱柱；SG2200H型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；咽炎清片，06 g/片（贵州百灵企业集团和仁堂药业有限公司；产品批号A20140720、A20140804、A20141101）；左旋龙脑对照品，供含量测定用（中国药品生物制品检定所，批号：111683-200604）；甲醇为Fisher色谱级纯度；实验室用水为Milli-Q超纯水。

2方法与结果

21对照品溶液的制备

精密称定左旋龙脑对照品约1016mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

样品溶液的制备 取咽炎清片10片，除去薄膜衣，精密称定，研细，混匀；精密称取约06g，置50mL容量瓶中，精密加甲醇25mL，称重；超声处理（功率250W，频率50Hz）30min，放冷，称重，甲醇补足减失的重量，静置，取上清液用微孔滤膜（045μm）滤过，即得。

22色谱条件

Agilent-1100型高效液相色谱仪，Neptune C-18（5μm，150×46mm）高效液相色谱柱；流动相A为水，B为甲醇（各含04%的磷酸）；进样量10μl；柱温：35℃；体积流量：08mL/min。

23专属性试验

取对照品、样品溶液各10μL，按照“22”项下方法测定，记录色谱图。左旋龙脑在101min出峰。图1为左旋龙脑对照品图谱，图2为咽炎清片样品溶液图谱，图3为咽炎清片辅料对照图谱。

24线性关系考察

将对照品溶液稀释成浓度分别为100、80、60、40、20和10μg/mL的对照品溶液，各吸取10μL，按“22”项下方法测定，记录峰而积，以峰而积为纵坐标（Y），以左旋龙脑浓度为横坐标（X），得回归方程Y=839e6X-388e4（r=09997，n=6），说明峰面积响应值Y与被测组份浓度X成正比[2]。

25稳定性考察

按“21”项下方法制备对照品溶液，使得左旋龙脑浓度为40μg/mL，于室温下放置，每隔2小时按“22”项下方法测定，左旋龙脑峰面积的RSD值为02%（n=7），结果表明含量测定所配置的溶液在12h内稳定。

26含量测定

取咽炎清片10片，精密称定（计算平均片重），除去薄膜衣，精密称定（计算平均片重），研细，精密称取约06g，置50mL容量瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50Hz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取上述续滤液，按“22”项下方法测定，记录峰面积，按外标法以峰面积计算供试品中左旋龙脑的含量。

27精密度试验

对同一批样品含量测定重复6次，结果咽炎清片去薄膜衣前后左旋龙脑含量的RSD值均为01%。说明含量测定方法的精密度良好。

28加样回收率实验

取咽炎清片10片，除去薄膜衣，精密称定（计算平均片重），研细，精密称取约04g，置具塞锥形瓶中，精密加入相当于样品中左旋龙脑的量约80%、100%、120%的左旋龙脑对照品甲醇溶液25mL，置同一具塞锥形瓶中，密塞，按照上述左旋龙脑含量测定法中，自“称定重量，超声处理”起，依法操作，按“22”项下方法测定，按外标法进行计算含量测定加样回收率。其结果见表1。

3讨论

本文首次建立了用于咽炎清片中左旋龙脑含量测定的HPLC法，左旋龙脑与其他药材和辅料的分离度良好，左旋龙脑浓度再在10～100μg/mL浓度范围内线性良好，回收率高，重复性好，稳定性试验证明左旋龙脑样品溶液在12 h内稳定性良好。目前，国内外对左旋龙脑的含量测定多用气相色谱法，作者尝试建立一种新方法，采用HPLC-RID法能够将咽炎清片中左旋龙脑分离完全，避免了其他组分和辅料的影响，而且由于仪器的普及性较高，方便了对制剂中左旋龙脑的质量控制。结果证明该方法简便易行，结果准确可靠，适用于咽炎清片中左旋龙脑的含量测定，能够为评价咽炎清片中左旋龙脑的质量提供可靠的保证。

按照咽炎清片质量标准《国家中成药标准汇编》口腔肿瘤儿科分册（WS-10329（ZD-0329）-2002），计算咽炎清片中左旋龙脑的理论含量约为079mg/片，而本文采用HPLC-RID法测定的含量为076mg/片，实际值比理论值稍低，这说明左旋龙脑这种易挥发性物质，即便在薄膜衣的包裹下，仍不可避免有极少量的损失。

参考文献：

[1]杨锐，孙会敏，张丽颖，等HPLC-示差折光检测器测定单硬脂酸甘油酯的含量[J]中国药事，2012，26（10）：1102.

[2]马朝阳，王远辉，田洪芸，等GC法测定左旋龙脑中的l-龙脑、异龙脑和樟脑[J]中草药，2012，12（43）：2428

[3]徐聪，李明炬用HPLC法测定咽炎清片中异嗪皮啶含量的研究[J]贵州医药，2004，28（10）：936

[4]方灿，陈琳气相色谱法测定艾纳香油中左旋龙脑的含量[J]中国医院药学杂志，2006，26（9）：1166

[5]吴丽芬，庞玉新，杨全，等GC法同时测定艾纳香油中5个主要成分的含量[J]药物分析杂志，2015，35（7）：1179

[6]王治平，孟祥平，樊化，等滇桂艾纳香挥发油化学成分的GC-MS分析[J]中草药，2005，36（8）：1138

[7]文永新，黃永林，朱廷春，等反相高效液相色谱法测定艾纳香中不同部位花椒油素的含量[J]时珍国医国药，2007，18（9）：2137

[8]夏稷子，彭金咏，赵智，等气相色谱法测定艾纳香中左旋龙脑的研究[J]中成药，2011，33（12）：2188