光合细菌对棉秆机械浆废液的转化条件研究

高 红，侯思琰

（1.天津现代职业技术学院，天津 300350；2.水利部海河水利委员会水资源保护科学研究所，天津 300170）

光合细菌对棉秆机械浆废液的转化条件研究

高 红1，侯思琰2

（1.天津现代职业技术学院，天津 300350；2.水利部海河水利委员会水资源保护科学研究所，天津 300170）

造纸过程中产生的棉浆废液是较难降解的高浓度有机废水，但利用其作为培养光合细菌的基质，生产有益微生物制剂，可实现循环经济。本文通过实验，稀释5倍的棉浆废液，当初始pH为7.0，培养温度为30℃时，最有利于光合细菌的生长。5 %的接种量，培养16h可使光合细菌达到较大密度；利用热风循环烘干箱，可实现光合细菌液的固定化，载体与菌体质量之比为1.5∶1。

棉杆机械浆；废液；光合细菌；培养基；生长条件

中国是农业大国，每年产生大量的棉秆废弃物，棉秆本身的化学形态及纤维结构使它成为一种较为优质的造纸原料，作为非木材纤维原料，棉秆在造纸工业中日益受到青睐。棉秆与APMP技术相结合已大规模应用于瓦楞原纸的本色浆生产，既能够缓解造纸资源紧缺，又达到废弃物资源化的目的。但随之而来的问题是APMP废水属于高浓度有机废水，用普通的生化方法较难处理。常用的厌氧(UASB)-好氧(SBR)组合技术可使APMP废水的CODCr去除率达90.3%，但仍未达到造纸工业废水污染物排放标准[1-2]。

棉浆废液中含有大量的纤维素及其分解产生的低分子量的半纤维素﹑甲醛﹑醋酸﹑乙酸﹑多糖﹑果胶﹑蛋白等多种营养物质，是一种天然的微生物培养基。通过研究，利用这些营养成分作为培养光合细菌的基质，生产出有益微生物制剂，可实现环境保护和循环经济的双重效果。

1 实验部分

1.1 主要仪器

QYC 200恒温空气摇床，SPECTRUM 756PC紫外分光光度计，X5-212显微镜，DELTA 320 pH计，SPX-150生物培养箱，CRMDX-280灭菌锅。

1.2 实验原料及实验菌种来源

实验研究的废液取自河北省某造纸厂利用棉秆作为造纸原料的APMP制浆后的挤出液，CODCr为43000mg·L-1左右，pH值为8左右，色度在30000倍以上。实验采用的光合细菌为实验室保藏的红假单孢菌。

2 试验方法

2.1 实验菌株的纯化

按照稀释平板分离法，将实验室保藏的光合细菌液稀释接种于平板上，于28～30℃﹑4000勒克斯(LX)的光源（相当于60W的白炽灯）下光照培养，至长出菌落为止。在平板上选择分离较好的有代表性的光合细菌单菌落接种斜面，同时作涂片检查，进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。纯化后的单菌落形态见表1。

表1 本菌株纯化后单菌落的形态Tab.1 The strains were purified single colony morphology

2.2 培养条件

在500mL三角烧瓶中进行光合细菌的培养。将稀释一定倍数的棉浆废液和光合细菌培养基各100mL分别装入三角烧瓶中，灭菌后调节pH值在7.0左右，接种光合细菌时母液OD660值为3.0。置于28℃﹑200 r·min-1的恒温空气摇床中振荡培养，一定时间后分别用血球板作菌的计数。同时测定光合细菌培养基培养过程中660nm下菌悬液吸光度的OD660值。作出菌浓度随时间变化的趋势图，即为该菌的生长曲线。

3 实验结果与分析

3.1 选择适宜的棉浆废液稀释倍数

实验所用废液为棉秆经APMP机械制浆后的挤出液，过程中只加入了NaOH碱液，以降低棉秆原料中纤维与木质素﹑半纤维素之间的结合强度，所以挤出废液中仍保留有棉秆本身的大量天然营养物质，这些成分非常适宜用作微生物培养基[3-4]。棉秆的主要化学成分见表2。

表2 棉秆的主要化学成分Tab.2 The main component of cotton stalk chemical

将棉浆废液分别稀释5﹑7.5﹑10﹑50﹑100倍后直接灭菌作培养基，接种5%光合细菌后，上摇床振荡培养18h，血球板计数。不同稀释倍数对光合细菌生长的影响如表3所示。

表3 不同稀释倍数下光合细菌的生长情况Tab.3 The growth of photosynthetic bacteria in different dilutions

表3的数据表明，直接稀释棉浆废液作为培养基，光合细菌可以生长，说明棉浆废液中的氮碳源及微量元素足以满足光合细菌生长的需要。在稀释5～100倍的范围内，稀释倍数越小，越有利于光合细菌的生长。但由于棉浆废液中有大量的不溶物存在，稀释倍数过大则不利于光合细菌的生长，故在后面的实验中选择5倍的稀释梯度。

3.2 光合细菌在两种不同培养基中的生长曲线

两种培养基中接种5 %的光合细菌，摇床振荡培养。每隔4h用血球板计数棉浆液培养基中的菌数，测定光合细菌培养基的吸光度，做生长曲线，并在光合细菌培养基最大吸光度下做光合细菌的计数。两种培养基中光合细菌的生长情况如图1﹑图2所示。

图1 光合细菌培养基中菌的生长情况Fig.1 Photosynthetic bacteria culture medium of bacteria

图2 棉浆废液培养基中菌的生长情况Fig.2 Cotton pulp waste liquid culture medium of bacteria

图1表明，在光合细菌培养基中，光合细菌在40h达到吸光度最大值，此时菌的密度最大，达到2×109个·mL-1。图2表明，光合细菌在棉浆液中16h就已基本达到稳定期，因此可以缩短光合细菌的培养时间，减少能耗。其稳定期的菌数与光合细菌培养基吸光度达到最大值时的菌数相比增长约有1倍，并且对数增长期提前，稳定期增长。资料表明[5]，有机酸以及糖类﹑维生素类物质含量较高，可以补充培养基中营养成分。同时，可以使培养基相对长时间地维持在适合红假单胞菌属生长的中性偏酸性环境中，这些对于光合细菌的生长都是有利的。

3.3 两种培养基中pH的变化

光合细菌在两种培养基中pH的变化情况如图3所示。图3表明，与光合细菌培养基相比，棉浆废液在培养光合细菌过程中pH有一较大幅度的降低，至指数生长初期达最低点(pH=6.6)。这一变化可能是棉浆废液中的糖类物质被细菌转化成有机酸，而后又被进一步利用的结果。偏酸性环境有利于红假单胞菌的生长。当棉浆废液组光合细菌生长接近稳定期时，培养液中的pH值已与对照组相差无几。

图3 光合细菌在两种培养基中pH的变化Fig.3 Photosynthetic bacteria in two kinds of medium pH change

3.4 不同接种量的影响

将棉浆废液分别接种2%﹑5%﹑10%﹑15%的光合细菌，在摇床培养16h后用血球板作计数，不同接种量对光合细菌生长的影响如表4所示。表4的数据表明，接种量过小，会影响最终菌的浓度。在5%～15%之间随着接种量提高，最终菌的浓度变化不大。故选择5 %的接种量。

表4 不同接种量下光合细菌的生长情况Tab.4 The growth of photosynthetic bacteria of different inoculation quantity

3.5 不同初始pH值的影响

将光合细菌以相同的接种浓度接种于棉浆废液培养基中，将初始pH值分别调节为6.0﹑6.5﹑7.0﹑7.5﹑8.5﹑9.5，28℃﹑黑暗﹑摇床振荡培养，在1d﹑3d后测定pH值。不同初始pH值下光合细菌的生长情况如表5所示。

表5 不同初始pH下光合细菌的生长情况Tab.5 The growth of photosynthetic bacteria under different initial pH

菌液pH的升高可作为光合细菌生长繁殖的标志，在初始pH为6.5～8.5的条件下试验，菌株均能生长，初始pH为7.0时生长效率最高，初始pH为8.5时，菌液的pH上升缓慢，故用棉浆废液培养光合细菌的最适pH为7.0左右。

3.6 最适生长温度的测定

在不同温度下振荡培养20h后，用血球板计数菌株生长量。光合细菌随温度的生长情况如图4所示。

图4 光合细菌随温度的生长情况Fig.4 Photosynthetic bacteria with the growth temperature

图4表明，温度过低或过高都会影响光合细菌的生长繁殖情况。培养温度在25～35℃范围内，菌株生长情况都较好，其中，30℃时菌株生长量达到最高，说明30℃是菌株的最适生长温度。

3.7 不同充氧方式下棉浆废液培养光合细菌的研究

在2.5L玻璃瓶中加入稀释5倍的棉浆废液，接种5%的光合细菌，微孔曝气使溶氧达到8 mg·L-1。每4h测定光合细菌的生长情况。光合细菌在两种充氧方式下的生长情况如图5所示。

图5 光合细菌在两种充氧方式下的生长情况Fig.5 The growth of photosynthetic bacteria in two oxygen chargingmode

图5表明，光合细菌在曝气培养条件下更早进入对数增长期，菌的浓度也比摇床培养的菌浓度大。16h菌的个数就达到5×109个·mL-1，这对工程中缩短培养光合细菌的时间，大规模培养光合细菌有非常重要的意义。

3.8 用载体固定棉浆废液培养的光合细菌

生物物料加热脱水常会引起热损伤，使活菌大量失活[6]。因此，在少量菌种保藏时常采用冷冻脱水或低温真空脱水。但若采用冷冻或低温真空干燥的方法进行工业规模的菌液脱水，会使产品的成本骤增。本试验将光合细菌吸附于载体上，采用低温热空气作为干燥介质使菌液脱水。试验以过10号筛后的锯末作为载体，与棉浆废液培养的光合细菌液（平均每mL含菌体40亿）按照重量比1.5∶1，将菌液均匀喷洒在载体上。由于细锯末为多孔性颗粒，故可吸附较多的菌液。将混合后的载体放入热风循环烘干箱中，设定温度为40℃，并启动风机排湿，直至测得载体水分低于10%为止。取载剂于装有无菌水的试管中充分振荡，沉淀后取澄清液平板计数，每g载体中有活菌2×109个，说明干燥后菌体存活率达到75 %。

4 小结

1）采用棉浆废液培养光合细菌，提高了光合细菌的菌株密度，促进了光合细菌生长，便于浓缩﹑制造固体菌制剂，降低了废水处理和菌体生产成本，为棉秆制浆废液资源化利用提供了一条新思路。

2）光合细菌在稀释一定倍数的棉浆废液中可以生长，且总菌数有较大提高，对数增长期提前且稳定期延长，缩短了培养周期。棉浆废液中的有机酸和纤维素等为光合细菌提供了营养成分，这与中草药的浸提液促进光合细菌的生长原理相似[7]。此外，棉浆废液中的有机酸均为弱酸，在培养液中起缓冲作用，有利于光合细菌的生长。

3）稀释5倍的棉浆废液，当初始pH为7.0，培养温度为30℃时最有利于光合细菌的生长；5 %的接种量，培养16h可使光合细菌达到较大密度，在工程上能缩短培养光合细菌的时间，减少能耗。

4）在2.5L玻璃瓶中曝气培养光合细菌，16h后菌数达到5×109个·mL-1，微孔曝气充氧方式可进一步提高光合细菌的菌株密度。利用热风循环烘干箱，可实现光合细菌液的固定化，载体与菌体质量之比为1.5∶1。

[1] 武书彬.造纸工业水污染控制与治理技术[M].北京：化学工业出版社，2001.

[2] E.Scholten, T.Lukow, G.Auling, RM.Kroppenstedt, F.Rainey, H.Diekmann. Thauera mechernichensis sp.nov., an aerobic denitrifier from a leachate treatment plant[J]. Int-J-Syst-Bacteriology, 1999, 49(3): 1045-1051.

[3] 王菊华.中国造纸原料纤维特性及显微图谱[M].北京：中国轻工业出版社，1999.

[4] 杨淑惠.植物纤维化学[M].北京：中国轻工业出版社，2001.

[5] 许兵，周新婷，徐怀恕，等.几种中草药对光合细菌生长的促进作用[J].青岛海洋大学学报，1994，24(1)：47-51.

[6] 潘永康，庞金钊，李占勇.光合细菌液吸附于载体的振动流化床干燥[J].食品与发酵工业，1995(1)：32-35.

[7] 荚荣，王怡平，洪旭华，等.中草药在光合细菌开发中的应用[J].中草药，1999， 30(4)：293-295.

Photosynthetic Bacteria Transforming Conditions of Cotton Stalk Mechanical Pulp Wastewater

GAO Hong1, HOU Siyan2
(1.Tianjin Modern Vocational Technology College ,Tianjin 300350,China; 2.Research Institute of Water Resources Protection Science of Haihe River Resources Committee ,Tianjin 300170,China)

Cotton pulp wastewater was high concentration organic wastewater and diffcult degradation. Using it as a microbial culture photosynthetic bacteria and benefcialmicrobial agents, could realize the circular economy. Through the experiment, cotton pulp wastewater diluted 5 times, initial pH=7, temperature 30℃ was most conducive to the growth of photosynthetic bacteria. Inoculation 5%, 16h of culture could make the photosynthetic bacteria reach the higher density. Using hot air circulation drying box, immobilized photosynthetic bacteria liquid could be realized, carrier, and the biomass mass ratio was 1.5: 1.

cotton stalk mechanical pulp; wastewater; photosynthetic bacteria; medium; growth conditions

X 793

A

1671-9905(2017)04-0045-04

高红（1981-），女，汉族，副教授，硕士，主要从事环境污染治理，E-mail：gh0121@126.com，Tel：13920631981

2017-02-23