茯苓多糖PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ作为疫苗佐剂的免疫原性

李海霞，刘坤璐，李文斐，贾培媛，于卫立，武军华，胡涛，王玉霞，单俊杰，孙国辉

（1.军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850；2.解放军第四军医大学航医系，陕西西安710032；3.中国科学院过程工程研究所，北京100190；4.中国人民解放军总医院消化科，北京100853；5.广西医科大学药学院，广西南宁530021）

茯苓多糖PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ作为疫苗佐剂的免疫原性

李海霞1，5，刘坤璐1，李文斐2，贾培媛3，于卫立3，武军华1，胡涛3，王玉霞1，单俊杰1，孙国辉4

（1.军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850；2.解放军第四军医大学航医系，陕西西安710032；3.中国科学院过程工程研究所，北京100190；4.中国人民解放军总医院消化科，北京100853；5.广西医科大学药学院，广西南宁530021）

目的研究茯苓多糖（PCP）中PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ作为疫苗佐剂的免疫原性。方法①采用钥孔戚血蓝蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA）为载体蛋白分别与PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ连接制备免疫抗原KLHPCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ及筛选抗原BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ。KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ分别与弗氏佐剂联用id免疫家兔2次，ELISA检测家兔血清中抗多糖抗体。②PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ单独im免疫小鼠2次，ELISA检测小鼠血清中抗多糖抗体。③PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ为佐剂分别配伍重组乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗（PRRSV）im或sc免疫小鼠2次，ELISA检测小鼠血清中抗多糖抗体。结果①KLH-PCP-Ⅰ或KLH-PCP-Ⅱ与弗氏佐剂联用免疫2次，可产生抗KLH和抗多糖抗体。②PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ单独im免疫小鼠2次，检测出低水平IgM抗体，未检测出IgG抗体。③HBsAg或PRRSV抗原联用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ免疫小鼠2次，未检出抗多糖IgG抗体。结论PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ本身免疫原性较弱，作为疫苗佐剂可能具有良好的安全性。

茯苓多糖；佐剂；抗体

茯苓（Poria）为非褶菌目多孔菌科茯苓属真菌茯苓〔Poria cocos（Schw.）Wolf〕的干燥菌核。茯苓中的多糖成分具有显著抗肿瘤、抗炎、抗氧化和免疫调节作用［1］。前期我们研究发现，茯苓多糖（Poria cocos polysaccharides，PCP）粗制品中2个多糖成分PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ对H1N1流感病毒灭活疫苗、乙肝疫苗抗原以及狂犬病病毒灭活疫苗均有显著的疫苗佐剂活性，能显著增强免疫动物体液免疫和细胞免疫反应能力，提高染毒后的存活率［2-3］。PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ均由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，PCP-Ⅰ的单糖摩尔比为岩藻糖︰甘露糖︰葡萄糖︰半乳糖=1.00︰1.81︰0.27︰7.27，PCP-Ⅱ的单糖摩尔比为岩藻糖︰甘露糖︰葡萄糖︰半乳糖=1.00︰1.63︰0.16︰6.29。PCP-Ⅰ的峰高相对分子质量为3.0×105，PCP-Ⅱ的峰高相对分子质量为2.9×105［2-3］。

本研究拟对PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的免疫原性进行研究。首先将钥孔戚血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）和牛血清白蛋白（bovine se⁃rum albumin，BSA）作为载体蛋白分别与PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ偶联，制备免疫抗原KLH-PCP-Ⅰ和KLHPCP-Ⅱ及筛选抗原BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ。然后将免疫抗原联用弗氏佐剂免疫家兔，同时也用PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ分别免疫小鼠。采用ELISA检测血清抗原特异性抗体水平，评价多糖佐剂的免疫原性，为今后PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ体内分布和代谢研究、作为疫苗佐剂开发的安全性评价提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和仪器

BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，18～20 g，购于军事医学科学院实验动物中心，许可证编号SCXK-（军）2012-0004；大耳白家兔，雌性，体质量1.8～2.2 kg，北京金牧阳实验动物养殖有限公司，许可证编号SCXX（京）2015-0005。PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ为军事医学科学院毒物药物研究所天然药物化学研究室制备。辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（H+L）和N-四甲基联苯胺购自北京中杉金桥生物技术公司；重组乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）由大连汉信生物制药有限公司生产；猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗（porcine reproductive and respiratory syndrome virus inactivated vaccine，PRRSV）NVDC-JXA1株购自广东永顺生物制药有限公司；KLH、BSA和抗小鼠亚类抗体购自Sigma公司；脱脂奶粉为伊利集团产品；其余试剂为国产分析纯。酶标仪（美国Thermo Scientific VARIOSKAN FLASH）；洗板机（美国Thermo Scientific WELL⁃WASH VERSA）。

1.2 KLH-PCP-Ⅰ，KLH-PCP-Ⅱ，BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ的制备

称取2 mg PCP-Ⅰ，溶于20 mmol·L-1醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 5.8）。然后加入高碘酸钠将PCP-Ⅰ的邻位羟基氧化成醛基，PCP-Ⅰ和高碘酸钠的终浓度分别为2 g·L-1和20 mmol·L-1。室温下避光反应20 min后，加入适量的乙二醇终止反应。用磷酸盐缓冲液20 mmol·L-1（pH 7.4）对反应液进行透析，随后加入KLH 2 mg和氰基硼氢化钠1 mg，于4℃反应过夜，得到多糖-蛋白偶联物KLH-PCP-Ⅰ。偶联物KLH-PCP-Ⅱ，BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ的制备方法与KLH-PCP-Ⅰ相同［4-5］。

1.3 KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ联用弗氏佐剂免疫方案及抗体检测

大耳白家兔6只，分为2组，每组3只，分别注射抗原KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ，每只300 μg。初次免疫配伍弗氏完全佐剂，免疫后28 d进行加强免疫；加强免疫配伍弗氏不完全佐剂。佐剂与抗原按1∶1比例（m/m）混合充分乳化，皮内多点注射。分别在免疫后14 d耳缘静脉取血，分离血清，酶联反应板分别包被KLH、BSA及检测抗原BSA-PCP-Ⅰ或BSA-PCP-Ⅱ，每只家兔血清样品采用ELISA检测抗KLH和抗多糖抗体水平。

1.4 PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ单独免疫方案及抗体检测

BALB/c小鼠18只，分为3组，每组6只，分别im生理盐水、PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ。PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的剂量为每只小鼠500 μg，生理盐水为0.1 mL。初次免疫后28 d进行同剂量加强免疫。分别在初次免疫和加强免疫后14 d剪尾采血，分离血清，采用ELISA测定抗多糖抗体水平。

1.5 HBsAg联用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ的免疫方案

HBsAg分别与PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ联用，分别采用sc和im 2种途径免疫小鼠2次，间隔28 d。HBsAg免疫剂量为每只小鼠2 μg，PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的剂量均为每只小鼠200 μg，具体免疫方案见文献［3］。分别采用BSA或BSA-PCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ包被酶联反应板，检测免疫小鼠血清中抗多糖抗体水平。

1.6 PPRSV联用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ的免疫方案

BALB/c小鼠24只，分为4组，每组6只。分别sc生理盐水、PRRSV、PRRSV+PCP-Ⅰ和PRRSV+ PCP-Ⅱ。PRRSV的剂量为每只小鼠10 μg，PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的剂量均为每只小鼠200 μg。初次免疫后28 d进行同剂量加强免疫，分别在免疫后14 d剪尾采血，分离血清，采用ELISA测定抗多糖抗体水平。

1.7 ELISA法检测血清抗多糖抗体滴度

家兔或小鼠血清用含0.1%吐温-20的磷酸缓冲溶液（PBST，pH 7.4）等比稀释。筛选抗原采用抗原包被液（碳酸盐缓冲液0.05 mol·L-1，pH 9.6）稀释至终浓度5 mg·L-1包被96孔板，每孔100 μL，4℃包被过夜。包被酶联反应板用PBST洗板3次，每孔加入250 μL 5%脱脂奶粉（PBS配制），37℃封闭1 h。后用PBST洗涤3次，加入稀释的家兔或小鼠血清每孔100 μL，37℃孵育1 h。PBST洗涤3次，然后加入HRP标记的羊抗兔IgG或HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体（PBST 1∶1000稀释），每孔100 μL，37℃孵育1 h。弃去二抗，PBST洗涤5次，再加入TMB底物显色液，每孔100 μL，室温避光显色15 min。加入0.2 mol·L-1硫酸溶液每孔50 μL终止显色，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度（A450nm）值。与正常对照动物比较，A450≥4倍时为抗体阳性。

2 结果

2.1 家兔血清中KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ特异性抗体水平

KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ作为免疫抗原，进行初次免疫和加强免疫。加强免疫后14 d，ELISA检测家兔血清中抗KLH和抗多糖的抗体水平（图1）。结果表明，①以KLH包被酶联反应板，检测出兔血清中产生高滴度水平的抗KLH抗体，滴度＞1∶200 000（图1A1，B1）；②以BSA包被酶联反应板，未检测出血清中含有抗BSA抗体（图1A2，B2）；③以BSA-PCP-Ⅰ或BSA-PCP-Ⅱ包被酶联反应板，检测发现血清中能产生较高滴度的抗PCP-Ⅰ或抗PCP-Ⅱ的多糖抗体，抗体滴度＞1∶25 000（图1A3，B3）。

Fig.1 Serum antibody titers of rabbits immunized with keyhole limpet hemocyanin-Poria cocospolysaccharidesⅠ（KLH-PCP-Ⅰ）（A）and KLH-PCP-Ⅱ（B）plus Freund adjuvant at 14 d after second immunization detected by ELISA.Each rabbit received KLH-PCP-Ⅰor KLH-PCP-Ⅱid at the dose of 300 μg，and 28 d after the first immunization the booster 300 μg was given.The titer of each serum sample from immunized rabbits was measured respectively.A1 and B1：anti-KLH antibody；A2 and B2：anti-BSA antibody；A3：anti-PCP-Ⅰantibody；B3：anti-PCP-Ⅱantibody.x±s，n=3.

2.2 PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ单独免疫小鼠血清中抗多糖抗体水平

小鼠分别im生理盐水、PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ2次，两次免疫间隔28 d，PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ免疫剂量为每只小鼠500 μg。采用ELISA测定初次和加强免疫IgG和IgM水平（图2和图3）。结果表明，①初次免疫后14 d，小鼠血清中均未检测出抗PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的IgG抗体（图2 A和B），也未检测到相应的IgM抗体（图3）。②加强免疫后14 d，小鼠血清中抗PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的IgG抗体水平仍与生理盐水组相同（图2 C和D），而产生了抗PCP-Ⅰ的IgM抗体，抗PCP-Ⅱ的IgM水平无明显变化（图3）。表明PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ单独免疫2次，可产生低水平的IgM，不能产生抗多糖的IgG抗体。

2.3 HBsAg联用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ免疫小鼠血清中抗多糖抗体测定

Fig.2 Serum IgG antibody titers of mice immunized im with PCP-Ⅰand PCP-Ⅱalone twice detected by ELISA.Each mouse received im PCP-Ⅰor PCP-Ⅱ500 μg，and 28 d after the first immunization the booster 500 μg was im given.Anti-PCP-Ⅰand anti-PCP-ⅡIgG titers in serum of mice were detected at 14 d after the first immunization（A and B）and at 14 d after the second immu⁃nization（C and D）.x±s，n=6.

HBsAg（2 μg）联用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ（200 μg），分别采用sc和im 2种途径免疫小鼠2次，在第2次免疫后14 d检测血清抗多糖抗体，采用BSA、BSAPCP-Ⅰ和BSA-PCP-Ⅱ包被酶联反应板，结果（图4）表明，①HBsAg联用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱim免疫2次，血清中抗多糖IgG水平与单独HBsAg和生理盐水组IgG水平均相近（图4 A和B）。②PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ作为佐剂与HBsAg联用，sc免疫2次，小鼠血清中仍未检测出抗多糖抗体（图4 C和D）。提示PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ与HBsAg联用im和sc免疫均不能产生抗PCP-Ⅰ和抗PCP-Ⅱ的多糖抗体。

2.4 PRRSV联用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ免疫小鼠血清中抗多糖抗体测定

PRRSV（10 μg）联用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ（200 μg）免疫小鼠2次，分别采用KLH-PCP-Ⅰ和KLH-PCP-Ⅱ包被，ELISA法检测免疫小鼠血清中抗多糖抗体（图5）。结果表明，PRRSV联用PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ多糖佐剂，血清中抗多糖抗体水平与生理盐水组和单独PRRSV组均相近，提示PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ作为佐剂与PRRSV疫苗联用，不能产生抗多糖抗体。

Fig.3 Serum IgM antibody titers of mice immunized im with PCP-Ⅰ（A）and PCP-Ⅱ（B）alone twice detected by ELISA.See Fig.2 for the mouse treatment.x±s，n=6.

Fig.5 Serum PCP IgG antibody titers of mice immu⁃nized with porcine reproductive and respiratory syn⁃drome virus inactivated vaccine（PRRSV）plus PCP-Ⅰ（A）and PCP-Ⅱ（B）by sc injections at 14 d after second vaccine.Each mouse received sc PRRSV 10 μg plus PCP-Ⅰor PCP-Ⅱ500 μg，and 28 d after the first immunization the booster was given.x±s，n=6.

Fig.4 Serum PCP IgG antibody titers of mice immunized with HBsAg plus PCP-Ⅰor PCP-Ⅱby im（A，B）or sc（C，D）injections at 14 d after second vaccine.Each mouse was immunized twice at an interval of 28 d with HBsAg 2 μg plus PCP-Ⅰ200 μg or PCP-Ⅱ200 μg.x±s，n=6.

3 讨论

多糖具有多种生物活性，与维持生物功能密切相关。多糖可作为广谱免疫促进剂，它不仅能激活巨噬细胞、T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞，还能促进细胞因子生成活化补体，从而在抗肿瘤、抗病毒以及抗衰老等方面具有独特的功效。多糖注射液也进入临床应用，如人参多糖和香菇多糖注射液联合化疗用于治疗晚期胃癌，可减轻晚期胃癌患者化疗所致不良反应，提高患者细胞免疫功能，改善患者生活质量［6-7］。

细菌中也存在多种多糖类物质，它们在细菌的识别、信号传递、黏附、感染及防御等方面发挥着重要作用，其中与致病性相关的包括荚膜多糖及脂多糖中的O抗原多糖等。荚膜多糖和O抗原多糖具有免疫原性，可刺激机体产生保护性抗体。这些多糖均属于T细胞非依赖抗原，进入机体后，通过与B细胞表面的抗原识别受体交联而激活B细胞，使B细胞分化为可分泌抗体的浆细胞。在整个免疫过程中并无T细胞参与，因此不会形成免疫记忆，产生的抗体主要是亲和力较低的IgM和IgG2［8-9］。由于荚膜多糖属于T细胞非依赖性抗原，对≤2岁儿童的免疫效果不佳，且不能诱导免疫记忆应答。目前解决的办法是将多糖偶联到蛋白质上成为结合疫苗，使其转化为T细胞依赖性抗原，以诱导更强的免疫保护效果。如伤寒Vi抗原与载体蛋白破伤风类毒素等结合转换成T细胞依赖性抗原，则可诱导较强的应答［10］。

近年来国内外学者发现，多种天然多糖具有良好的疫苗佐剂的活性，通过与灭活疫苗或蛋白亚单位抗原合用，能明显增强疫苗的免疫效果，促进机体特异性或非特异性免疫、细胞免疫与体液免疫，而多糖自身具有天然、低毒和无药物残留等优点，已成为疫苗佐剂研究的一个热点［11］。国外已将落叶松中阿拉伯半乳聚糖作为肺炎疫苗佐剂用于临床Ⅱ期试验，壳聚糖用于HIV疫苗也在临床试验中，均表明能有效提高疫苗的免疫反应，而未显示明显的不良反应［12-13］。

已有文献报道，PCP粗制品对禽疱疹病毒1型（又称马雷克病病毒，Gallid herpesvirus 1，Marus disease virus）活毒株及流感病毒灭活疫苗有较好的佐剂活性，能提高免疫动物的体液免疫功能［14-15］，但未对其活性多糖成分进行深入研究。本课题组采用OVA抗原也证实，PCP粗制品具有良好的佐剂活性［16］。继而采用H1N1流感灭活疫苗和HBsAg对PCP粗制品中活性多糖成分进行追踪和评价，发现了PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ2个活性多糖佐剂。目前已评价了它们对炭疽PV抗原、狂犬病病毒灭活疫苗、PRRSV灭活疫苗和猪口蹄疫O型病毒灭活疫苗的作用，均显示具有良好的佐剂活性，其效果优于铝佐剂。此外，本课题组将其按每只小鼠500 μg剂量肌内连续免疫小鼠3次，每次间隔28 d，尚未发现PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ对小鼠血液生化指标、肝功能和肾功能有不良反应（待发表）。

由于PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ的相对分子质量均＞5000，因此观察其作为疫苗佐剂本身是否具有免疫原性。本研究发现，它们与KLH化学偶联免疫家兔可产生高滴度抗原特异性抗体，多糖单独免疫小鼠2次，仅产生低水平IgM抗体。PCP-Ⅰ或PCP-Ⅱ作为疫苗佐剂与HBsAg和PRRSV灭活疫苗联用免疫小鼠，小鼠血清中能检测出高滴度抗原特异性抗体，而未检出多糖特异性IgG抗体。提示PCP-Ⅰ和PCP-Ⅱ本身免疫原性弱，安全性良好。本研究为PCP的进一步研究和开发提供了有力的安全依据。

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Immunogenicity of Poria cocos polysaccharides PCP-Ⅰand PCP-Ⅱas vaccine adjuvants

LI Hai-xia1,5,LIU Kun-lu1,LI Wen-fei2,JIA Pei-yuan3,YU Wei-li3,WU Jun-hua1,HU Tao3, WANG Yu-xia1,SHAN Jun-jie1,SUN Guo-hui4
(1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China; 2.School of Aerospace Medicine,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China; 3.Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China; 4.Department of Gastroenterology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853,China; 5.School of Pharmaceutical,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

OBJECTIVETo investigate the immunogenicities of Poria cocos polysaccharides, PCP-Ⅰand PCP-Ⅱ,as a vaccine adjuvant.METHODS①Keyhole limpet hemocyanin(KLH)was linked to PCP-Ⅰor PCP-Ⅱrespectively to prepare immuno-antigen KLH-PCP-Ⅰor KLH-PCP-Ⅱ.Bovine serum albumin(BSA)was also linked to PCP-Ⅰor PCP-Ⅱrespectively to prepare screening-antigen. Rabbits were immunized with KLH-PCP-Ⅰor KLH-PCP-Ⅱplus Freund adjuvant by intradermal injection twice,and serum specific antibody titers were determined by ELISA.②BALB/c mice were immunized with PCP-Ⅰor PCP-Ⅱalone intramuscularly twice,and serum polysaccharide antibody titers were determined by ELISA.③BALB/c mice were co-immunized intramuscularly or subcutaneously with PCP-Ⅰor PCP-Ⅱplus hepatitis B surface antigen(HBsAg)or porcine reproductive and respiratory syndrome virus inactivated vaccine(PRRSV)twice,and serum polysaccharide-antibody titers were determined by ELISA.RESULTS①Serum anti-KLH and anti-polysaccharides(PCP-Ⅰor PCP-Ⅱ)antibodies were pro⁃duced after rabbits were immunized with KLH-PCP-Ⅰor KLH-PCP-Ⅱplus Freund adjuvant twice.②Serum anti-PCP-Ⅰor anti-PCP-Ⅱantibodies were not found after mice were immunized with PCP-Ⅰand PCP-Ⅱalone twice.③After mice were immunized with HBsAg or PRRSV plus PCP-Ⅰor PCP-Ⅱtwice,serum anti-PCP-Ⅰor anti-PCP-Ⅱantibodies were not found.CONCLUSIONPCP-Ⅰand PCP-Ⅱshow weak immunogenicity,which may be quite safe as a vaccine adjuvant.

Poria cocos polysaccharides;adjuvant;antibody

WANG Yu-xia,E-mail:wangyuxia1962@hotmail.com,Tel:(010)66931645;SHAN Jun-jie, E-mail:shanjunjie001@126.com,Tel:(010)66930644;SUN Guo-hui,E-mail:sungh301xhk@163.com,Tel:(010)55499206

R967

：A

：1000-3002-（2017）03-0255-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.009

2016-08-05接受日期：2017-03-05）

（本文编辑：齐春会）

李海霞，女，硕士研究生，主要从事多糖免疫活性研究，E-mail：lihaixiayes@163.com

王玉霞，E-mail：wangyuxia1962@hotmail.com，Tel：（010）66931645；单俊杰，E-mail：shanjunjie001@126. com，Tel：（010）66930644；孙国辉，E-mail：sungh301xhk@ 163.com，Tel：（010）55499206