葛根素对老年大鼠抗氧化作用的研究

李博萍, 刘秀丽, 邱 倩

(陇东学院, 1. 岐伯医学院; 2. 生命科学与技术学院, 甘肃 庆阳, 745000)



论 著

葛根素对老年大鼠抗氧化作用的研究

李博萍1, 刘秀丽2, 邱 倩1

(陇东学院, 1. 岐伯医学院; 2. 生命科学与技术学院, 甘肃 庆阳, 745000)

目的 研究葛根素对老年大鼠的抗氧化作用。方法 取10只2月龄大鼠为对照组，取30只12月龄SD老年大鼠，分为阴性对照组，阳性对照组和葛根素组，服药组每日灌服25 mg/kg脱水淫羊藿素，阳性对照组每日灌服15 mg/kg U-74006F, 青年大鼠和老年大鼠对照组灌服给予等体积蒸馏水。2个月后麻醉处死大鼠。取血清检测氧化产物丙二醛(MDA)含量，同时检测血清中总抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子超氧化物歧化酶(SOD)和 谷胱甘肽(GSH-Px)的活性。剥离大鼠肝脏和脑组织，研磨提取总蛋白后检测MAD含量，检测组织中T-AOC、SOD和GSH-Px活性。研磨脑组织后提取总RNA后, RT-PCR检测SOD和过氧化氢酶(CAT)基因表达量。结果 与青年大鼠相比，老年大鼠血清、肝脏和脑组织中MDA含量显著升高。同时血清和组织中抗氧化因子T-AOC、SOD和GSH-Px活性显著下降。老年大鼠服药后，与阴性对照组相比，葛根素和U-74006F均能显著降低老年大鼠血清和肝脏组织中MDA含量，但以阳性药物U-74006F效果最为明显，与葛根素组相比具有统计学意义。此外，与阴性对照组相比，葛根素和U-74006F均能显著提高血清和肝脏组织中T-AOC、SOD和GSH-Px的活性。阳性药物U-74006F能够显著降低脑组织中MAD的含量，同时提高抗氧化因子T-AOC、SOD和GSH-Px活性，然而葛根素对于脑组织中MAD的含量和SOD、GSH-Px活性无显著影响，但能够显著提高总抗氧化能力T-AOC的活性。此外, RT-PCR检测结果显示，葛根素和U-74006F均能显著肝脏组织中SOD和CAT基因表达量。结论 葛根素能够显著提高老年大鼠体内抗氧化因子的活性，降低氧化产物的含量，对于老年大鼠具有很好的抗氧化作用。

老年大鼠; 抗氧化; 葛根素; SOD

葛根素是豆科植物葛根的主要成分，其具有提高免疫力，增强心肌收缩力，保护心肌细胞，降低血液，抗血小板凝集等作用[1-3]。研究[4-6]表明，葛根的主要提取物葛根黄酮和葛根素具有较强的抗氧化能力，其对于DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基都很强的抑制能力。本文探讨葛根素对老年大鼠是否具有抗氧化能力，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验药物

葛根素对照品购自宝鸡市辰光生物科技有限公司，分子式为C12H20O9, 批号为20140711, 纯度为99.04%。将葛根素用蒸馏水配制成2.5 mg/mL的悬浮液，按照大鼠体质量每100 g灌服2.5 mg药物进行灌胃处理。

1.2 动物

2月龄SD雌性大鼠10只, 12月龄SD雌性大鼠30只，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(甘)2016-0001。

1.3 试剂

丙二醛(MDA)测定试剂盒，购自南京建成，批号: 20160325; 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒，购自南京建成，批号: 20161021; T-AOC测定试剂盒，购自南京建成，批号: 20160915; 谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定试剂盒，购自南京建成，批号: 20160925。RNAiso Reagent购自TaKaRa公司，批号: AA4602-1; 反转录试剂盒购自TaKaRa公司，批号: AK5302; Taq DNA聚合酶和Easy D ilution稀释液均购自TaKaRa公司，批号: AK7703。引物由TaKaRa公司设计并合成。U-74006F购自Sigma公司，批号: 071M4821V。

1.4 仪器

酶标仪(美国Bio-Rad), 紫外分光光度计(德国Heraeus), 台式高速冷冻离心机(德国Heraeus), 实时荧光定量PCR仪(美国ABI)。

1.5 实验方法

1.5.1 实验分组与处理: 10只2月龄大鼠为对照组, 10只12月龄大鼠为阴性对照组, 10只12月龄大鼠服用U-74006F为阳性对照组, 10只12月龄大鼠为葛根素组，葛根素用蒸馏水配成2.5 mg/mL的悬浮液，按每只大鼠25 mg/kg体质量给药。U-74006F用蒸馏水配成1.5 mg/mL的悬浮液，按每只大鼠15 mg/kg体质量给药。服药组每日灌服U-74006F或葛根素，对照组给予等体积蒸馏水。灌药60 d后麻醉处死大鼠，心脏取血后4 000 r/min离心10 min, 提取血清。同时剥离肝脏、脑组织后, -80 ℃保存。

1.5.2 血清中MDA、T-AOC、SOD和GSH-Px测定：药物处理大鼠60 d后, 10%水合三氯乙醛麻醉处死大鼠，腹腔静脉缺血后, 4 000 r/min离心10 min, 提取血清，根据试剂盒说明书操作测定各项指标。

1.5.3 肝脏和脑组织中MDA、T-AOC、SOD和GSH-Px测定：大鼠灌药60 d后, 10%水合三氯乙醛麻醉处死，剥离肝脏和脑组织，取1 g组织并无菌PBS清洗3次，剪碎组织后加液氮研磨，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液300 μL, 冰浴裂解5 min, 12 000 r/min离心15 min，取上清提取总蛋白后，进行蛋白定量，根据试剂盒说明书操作测定各项指标。

1.5.4 RT-PCR检测：大鼠灌药60 d后, 10%水合三氯乙醛麻醉处死，剥离脑组织，无菌PBS清洗3次后，加液氮研磨后，加入Trizol后提取总RNA, 紫外分光光度计检测RNA的浓度及纯度，利用逆转录试剂盒合成cDNA后，取2 μL进行RT-PCR检测，逆转录过程及RT-PCR过程参照说明书进行。最终结果以GAPDH为内参，结果利用2-ΔΔCt表示。引物信息见表1。

表1 Real Time PCR引物序列

1.6 统计学方法

数据采用SPSS 20.0软件处理数据，各组间是否存在差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)分析，两组间的差异比较用 LSD 检验法(方差齐)来判断是否有显著性差异,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 葛根素对血清中MDA、SOD、T-AOC和

GSH-Px的影响

血清中MAD检测结果显示，老年大鼠MAD含量显著高于青年大鼠(P<0.01), 当老年大鼠服用U-74006F和葛根素后，血清中MAD含量显著降低，与老年大鼠组相比差异有统计学意义(P<0.01)。血清中总抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性检测结果显示，与青年大鼠相比，老年大鼠T-AOC、SOD和GSH-Px的活性显著降低，当服用U-74006F和葛根素后，老年大鼠T-AOC、SOD和GSH-Px的活性均有不同程度的升高，与老年大鼠相比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。说明葛根素具有降低老年大鼠血清中氧化因子的含量，提高抗氧化因子活性的能力。见表2。

表2 葛根素对血清中MDA、T-AOC、SOD和GSH-Px的影响(n=10)

与青年大鼠组比较, **P<0.01; 与老年大鼠组比较, △P<0.05, △△P<0.01。

2.2 葛根素对肝脏组织中MDA、T-AOC、SOD和

GSH-Px的影响

与青年大鼠相比，老年大鼠肝脏中MAD的含量显著增加(P<0.01), 同时总抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性均显著低于青年大鼠(P<0.01)。老年大鼠服用U-74006F和葛根素后，与老年大鼠相比，服药组MAD的含量显著降低(P<0.01)。同时，服药组总抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性显著高于老年大鼠组(P<0.01), 但与青年大鼠组相比，服药的老年大鼠SOD和GSH-Px活性仍相对降低(P<0.01)。说明葛根素能够降低老年大鼠肝脏中氧化因子的含量，具有提高老年大鼠抗氧化因子活性的能力。见表3。

表3 葛根素对肝脏组织中MDA、T-AOC、SOD和GSH-Px的影响(n=10)

与青年大鼠组比较, *P<0.05, **P<0.01; 与老年大鼠组比较, △△P<0.01。

2.3 葛根素对脑组织中MDA、T-AOC、SOD和

GSH-Px的影响

脑组织中MDA检测结果显示，老年大鼠MAD含量显著高于青年大鼠(P<0.01), 当老年大鼠服用U-74006F, 血清中MAD含量显著降低(P<0.01), 然而服用葛根素的大鼠MAD含量略高于老年大鼠组，与后者比较差异无统计学意义(P>0.05)。与青年大鼠相比，老年大鼠总抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性显著低于青年大鼠组(P<0.01), 当老年大鼠服用U-74006F后，总抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性显著高于老年大鼠组(P<0.01)。而服用葛根素的大鼠，其抗氧化因子SOD和GSH-Px活性与老年大鼠组相比无显著差异(P>0.05), 而葛根素组大鼠总抗氧化能力T-AOC显著高于老年大鼠(P<0.01)。说明葛根素对老年大鼠脑组织中的氧化物含量及抗氧化因子活性物显著影响，但能够提高总抗氧化能力。见表4。

2.4 葛根素对大鼠脑组织SOD和CAT基因表达

的影响

与青年大鼠相比，老年大鼠SOD和CAT的基因表达量显著下降(P<0.01)。当老年大鼠服用U-74006F和葛根素后，老年大鼠SOD和CAT的基因表达量有显著上升，与老年大鼠相比差异有统计学意义(P<0.01), 但与青年大鼠相比仍显著较低(P<0.01)。见表5。

表4 葛根素对脑组织中MAD、T-AOC、SOD和GSH-Px的影响(n=10)

与青年大鼠组比较, **P<0.01; 与老年大鼠组比较, △△P<0.01。

表5 葛根素素对脑组织中 SOD和CAT基因表达量的影响(n=10)

与青年大鼠组比较, **P<0.01;

与老年大鼠组比较, △P<0.05, △△P<0.01。

2.5 葛根素对脑组织中SOD和CAT蛋白表达的影响

与青年大鼠相比，老年大鼠SOD和CAT的蛋白表达量显著下降。当老年大鼠服用U-74006F和葛根素后，老年大鼠SOD和CAT的蛋白表达量有明显上升，且病理切片显示, SOD和CAT在脑组织中具有共定位现象。见图1。

图1 SOD和CAT免疫组织荧光染色结果

3 讨 论

葛根素是豆科植物葛根的主要成分，其具有抗心律失常、抗心肌缺血、提高免疫力等功效。研究表明，葛根素具有很好的抗氧化活性。研究[7]表明，葛根素能够显著提高HaCaT细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)的活性，统计能够降低细胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MAD)的含量。研究[8]表明，葛根素能够降低过氧化氢诱导的人血管内皮细胞MAD含量增加的现象，葛根素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用。

本研究表明，葛根素能显著降低血清和肝脏组织中的MAD的含量，同时提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPH-Px)和总抗氧化能力(T-AOC)的活性，此外，葛根素能够显著提高肝脏中SOD和过氧化氢酶(CAT) mRNA的表达量。然而，葛根素对于脑组织中MAD含量及SOD和GPH-Pχ活性影响不大。因而作者推测，葛根素对于老年大鼠肝脏和血清具有很好的抗氧化活性。体外研究[9]表明，葛根素在多种细胞中具有抗氧化活性，葛根素能够保护氧化应激导致的BMSCs损伤，提高细胞增殖能力，增强细胞碱性磷酸酶活性，降低细胞内活性氧含量，抑制细胞凋亡，葛根素通过抗氧化作用，抑制细胞凋亡，发挥对BMSCs氧化损伤的保护。研究[10]表明，葛根素能够提高肺组织细胞SOD的活性，降低一氧化氮和MAD的含量。研究[11]表明，葛根素抑制过氧化氢诱导大鼠晶体上皮细胞凋亡，对该细胞具有很好的抗氧化保护作用。因此，葛根素对老年大鼠其它组织是否具有抗氧化活性仍待研究。

综上所述，本文表明葛根素能够显著降低老年大鼠血清和肝脏组织中氧化因子的含量，提高其抗氧化因子的活性。葛根素对肝脏组织具有很好的抗氧化活性，但其对脑组织的抗氧化作用不明显。

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Antioxidant activities of puerarin on aged rats

LI Boping1, LIU Xiuli2, QIU Qian1

(1.QiboMedicalSchool; 2.SchoolofLifeScienceandTechnology,LongdongUniversity,Qingyang,Gansu, 745000)

Objective To explore the antioxidant activities of puerarin on aged rats. Methods Ten 2-month-old SD rats were selected as control group. Thirty 12-month-old SD rats were divided into negative control group, positive control group and puerarin group. Rats in medication were given an oral administration of 25 mg/kg puerarin and 15 mg/kg U-74006F, while other rats were given an administration of same volume of distilled water. Two months later, all the rats were sacrificed and blood was collected, and serum level of malondialdehyde (MDA) and activities of total antioxidant activity (T-AOC), superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH-Px) were measured. The levels of MAD and activities of T-AOC, SOD and GSH-Px in liver and brain were also detected. Besides, the mRNA expressions of SOD and CAT in liver were analyzed in all the groups. Results The serum level of MDA and the activities of T-AOC, SOD and GSH-Px in aged rat group were significantly lower than young rat group. After the treatment of puerarin and U-74006F, the serum and liver levels of MDA decreased and the activities of SOD, T-AOC and GSH-Px increased significantly, and were significantly higher than aged rat group. The level of MDA decreased and the activities of SOD, T-AOC and GSH-Px increased significantly in brain after the treatment of U-74006F. Puerarin had no effects on MAD, SOD and GSH-Px except increased the activity of T-AOC. The mRNA expression of SOD and CAT of aged rat were significantly lower than young rat group, and after puerarin treatment this phenomenon was weakened. Conclusion Puerarin can increase the activities of antioxidant factors and had notable antioxidant functions on aged rats.

puerarin; antioxidant; aged rat; SOD

2017-02-05

甘肃省科技计划项目(1606RJYM226)

R 284

A

1672-2353(2017)07-001-04

10.7619/jcmp.201707001