异氟醚对人乳腺癌MDA—MB—231细胞的影响及相关机制探讨

冯娟　吴满武

[摘要] 目的 探讨异氟醚对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖凋亡的影响机制。 方法 采用MTT法观察异氟醚作用24 h对MDA-MB-231细胞（密度5×105/孔）增殖能力的影响；采用Western blot法检测磷酸化Akt（蛋白激酶B，protein kinase B），Bcl-xl（B细胞淋巴瘤/白血病-xl基因，B-cell lymphoma-extra large）、Bad（人促凋亡蛋白，Human apoptosis protein）的蛋白表达情况，以探究其对细胞凋亡的调控机制。 结果 （1）异氟醚对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用，随着时间的延长逐渐增强，与对照组相比，差异均有显著统计学意义（P<0.05）。结果可见异氟醚对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖起到抑制作用，且具有明显的量效与时效关系；（2）各组磷酸化 Akt 的表达变化差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，异氟醚组磷酸化 Akt 在麻醉24 h 降低63.1%（P<0.05），48 h及72 h均呈回升趋势（P<0.05）；（3）实验组各时点Bad表达的变化差异没有统计学意义（P>0.05）。但各时点 Bcl-xl 表达的变化有显著差异（P<0.05），72 h Bcl-xl 表达较对照组下降82.2%（P<0.05）。 结论 异氟醚可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，并可通过Akt/Bad细胞通路诱导其细胞凋亡。

[关键词] 异氟醚；乳腺癌；MDA-MB-231细胞；增殖；凋亡

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）05-0008-04

大量报道已证实[1，2]，异丙酚能抑制乳腺癌细胞增殖及转移能力，是乳腺癌根治术的常用麻醉药物之一。而同样作为常用吸入麻醉药物的异氟醚，是否也对乳腺癌细胞存在以上作用？目前，还有研究报道，异氟醚对脑发育关键期也称突触发育期的哺乳动物具有神经毒作用，表现为远期认知功能障碍、神经细胞凋亡增加、突触棘形态改变和社会行为的异常[3-5]。因此，本研究设计体外培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞，给予异氟醚进行干预，通过观察细胞的增殖情况及通过测定细胞凋亡标志蛋白Akt、Bcl-xl、Bad的变化情况，来进一步探究异氟醚诱导MDA-MB-231细胞毒性机制，为临床有效防治乳腺癌提供有力的数据支持。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人乳腺癌细胞MDA-MB-231（南京凯基生物科技发展有限公司），异氟醚（日本MaruishiPharma-ceutical公司，批号：YDST1109），DMEM培养基（美国Gibco公司，批号：34716），胎牛血清（美国Hyclone公司，批号：67186），色素抑制剂1-苯基-2-硫脲（PTU，美国Sigma公司，批号12979），兔抗人Akt单克隆抗体，兔抗人磷酸化Akt单克隆抗体（ser473）；β-actin 单克隆抗体（美国invitrogen公司），兔抗人Bcl-xl多克隆抗体，兔抗人Bad 多克隆抗体（均购自美国CellSignal 生物技术公司），羊抗兔二抗（武汉博士德公司）。

1.2 细胞培养及干预处理

将复苏后的细胞放入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃，5%CO2的培养箱中常规培养。显微镜下观察细胞生长情况，每隔2～3 d用0.25%胰酶消化，以1：2传代。取对数生长期细胞进行实验，经消化、计数后，以5×105个/mL（1 mL/孔）的细胞密度接种于96孔板中，培养24 h后，将培养板置于密闭容器内，置于37℃恒温水浴锅中。设立对照组后，将各组细胞置于密闭容器中，并在进气口处连接leon麻醉机，出气口处连接leon麻醉气体监测仪。实验组通入3.4%～3.5%七氟醚-5%CO2-O2，对照组通入95%O2-5%CO2。在气体流量1 L/min的条件下，各组均孵育6 h，孵育结束后继续常规培养24 h。

1.3 MTT法检测细胞增殖情况

各组96孔板中分別加入配制好的浓度为5 mg/mL 20 μL MTT，对每个孔中的细胞进行染色，在λ=490 nm的酶标仪读出每孔的OD值，并根据试剂盒说明书计算各组细胞的抑制率。细胞抑制率（%）=1-（试验组吸光度值/ 对照组吸光度值）×100%。

1.4 Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白

每组各取6个培养孔并收集其中细胞，提取细胞总蛋白，蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入检测蛋白对应的兔抗人一抗（稀释度1：500），4℃下孵育过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（稀释度1：2 000），室温下孵育2 h。ECL显色，扫描图像后采用凝胶成像分析系统分析条带灰度值，以目标条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映目标蛋白表达情况。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件对所得数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析和t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1异氟醚对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

异氟醚对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用结果如表1所示，统计结果表明，异氟醚对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用，随着时间的延长逐渐增强。与对照组相比，差异均有显著统计学意义（P<0.05）。结果可见异氟醚对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖起到抑制作用，且具有明显的量效与时效关系。

2.2 磷酸化Akt蛋白表达的变化

如表2，各组磷酸化 Akt 的表达变化差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，异氟醚组磷酸化 Akt在麻醉24 h降低67.3%（P<0.05），48 h及72 h均呈回升趋势（P<0.05），提示异氟醚抑制磷酸化Akt表达。

2.3 Bcl-xl/Bad比值的变化

各时点Bcl-xl 表达的变化差异没有统计学意义（P>0.05）。但各时点 Bad 表达的变化有显著差异（P<0.05），72 h Bad表达较对照组下降 82.2%（P<0.05）。结果提示异氟醚对Bad表达影响不大，而能降低Bcl-xl表达，从而降低Bcl-xl/Bad 比值（P<0.05）。

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，且致死率高，预后差，严重影响患者生活质量。有研究已经证实，乳腺癌的发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%，其发病率仍呈逐年增加趋势[6-8]。因此，如何有效治疗乳腺癌是当前亟待解决的医学难题[9]。近年来，随着现代医学科技的飞速发展和肿瘤治疗理念的不断更新，传统的以根治性手术为主的乳腺癌治疗模式被广大临床工作者质疑，而多学科的合理的综合治疗的呼声越来越高。目前，临床综合疗法多为手术配合放化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗、生物治疗等[10，11]。但任何一种疗法都有自身的优势与不足，且难以达到治愈效果。由此，寻找多靶点、新靶向且更深入探究高效、低毒的抗癌药物成为近年来国内外研究热点之一[12]。

多篇研究[13-15]报道显示，异氟醚能诱导突触，使其呈上调状态，从而促使发育高峰期的动物脑神经细胞凋亡。因此，本研究拟用异氟醚干预体外培养的人乳腺癌MDA-MB-231细胞，通过观察细胞的增殖情况，以证实其抑制乳腺癌的作用效果，同时也通过测定细胞凋亡相关蛋白的变化情况，来进一步探究异氟醚诱导MDA-MB-231细胞毒性机制，为临床有效防治乳腺癌提供有力的数据支持。

本次研究重点观察了Akt，研究结果显示各组磷酸化 Akt 的表达变化有明显差异。与对照组相比，异氟醚組磷酸化Akt在麻醉24 h降低67.3%，48 h及72 h均呈回升趋势，提示异氟醚抑制磷酸化Akt表达。Akt其主要通过PI3K激活，从而作用于下游的Bad、Caspase 9等底物或下游因子抑制细胞凋亡[16，17]。可以认为，激活后的Akt是抗凋亡和保护丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化的细胞屏障。因此，本次研究重点观察了异氟醚干预后的人乳腺癌MDA-MB-231细胞中Akt的表达情况，所得实验结果与前期及文献报道结果相符。原癌基因蛋白Bcl-2家族，是一类细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高度保守。其中的Bad蛋白，具有较强的促进细胞凋亡的作用，Bcl-xl则是相反的具有抗凋亡作用，两者表达失去平衡将会促进细胞的凋亡。研究已经证实，当机体处于磷酸化状态下时，Ser136/Ser112残基被Akt的激活，从而减少下游的Bad蛋白的表达，Bcl-xl表达相对较多，此时，细胞凋亡被抑制[18，19]。本次实验结果也显示，实验组各时点Bcl-xl 表达的变化没有显著差异，但各时点Bad表达的变化有显著差异，72 h Bad表达较对照组下降82.2%。该结果也证实，异氟醚对人乳腺癌MDA-MB-231细胞Bcl-xl/Bad的蛋白表达存在一定影响，从而也在一定程度上证实了异氟醚具有细胞毒性作用，可促使MDA-MB-231细胞凋亡，这可能是异氟醚治疗乳腺癌的机制之一，后续仍需要大量是实验数据进一步对其进行支撑[20]。异丙酚和七氟烷也是临床上常用的麻醉药，曾有学者研究研究了异丙酚和七氟烷对人乳腺癌癌细胞迁徙的影响差异，研究结果表明两种麻醉药对人乳腺癌细胞株的侵袭和迁移能力的影响没有较大差异。关于其他常用麻醉药之间效果比较，还需要我们进一步的探索和证实。综上所述，异氟醚可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，并可通过Akt/Bad细胞通路诱导其细胞凋亡。但仍有很多实验需要我们去证实和探索。

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（收稿日期：2016-11-20）