miRNA-Let-7b调控胃癌顺铂耐药性的机制研究

韩啸 张竞竞 韩正全

miRNA-Let-7b调控胃癌顺铂耐药性的机制研究

韩啸 张竞竞 韩正全

目的 探究miRNA-Let-7b调控胃癌细胞顺铂化疗耐药的分子机理。方法 将胃癌细胞系SGC-7901耐药株作为研究对象，采用RT-PCR法对miRNA-Let-7b在胃癌细胞中的表达水平进行检测，对细胞存活情况、转染前后细胞增殖情况及凋亡情况进行综合分析。结果 SGC-7901/DDP细胞miRNA-Let-7b表达水平是SGC-7901的（27．37±2．84）%（P＜0．05），差异有统计学意义；SGC-7901转染Let-7b inhibitor后对顺铂的敏感性降低（P＜0．05），差异有统计学意义，SGC-7901转染miRNA-Let-7b minmic后对顺铂的敏感性则得到了增强（P＜0．05）；SGC-7901转染miRNA-Let-7b mimic后，细胞凋亡率增强，高于对照组（P＜0．05），差异有统计学意义。结论 miRNA-Let-7b表达水平的降低能够在一定程度上加快胃癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，使胃癌细胞对顺铂敏感度降低，为临床抗癌药物的研发提供参考。

miRNA-Let-7b；胃癌细胞；顺铂；耐药性；分子机理

作为临床中一种极为常见的消化道肿瘤疾病，胃癌具有较高的发病率与死亡率，严重威胁着人们的生命安全。通常胃癌患者在就医时已发展成为晚期，多采用化疗治疗。当前临床中对胃癌的化疗治疗效果并不理想，这很大程度上是由于胃癌细胞对化疗药物的耐药性造成的[1-2]。此次研究探究了miRNALet-7b调控胃癌细胞顺铂化疗耐药的分子机理，并对研究结果做出相应总结。

1 材料与方法

1.1 实验材料

此次研究所采用的人胃癌细胞株SGC-7901细胞株由上海泽叶生物科技有限公司提供，顺铂DDP由云南生物谷药业股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用10%灭活胎牛血清DMEM高糖培养液对人胃癌细胞株SGC-7901及耐药细胞株SGC-7901/DDP于5%CO2、37℃环境下进行培养，饱和湿度为85%，并选择处于指数期生长细胞进行研究。

1.2.2 细胞RNA提取及完整性检测 将SGC-7901及SGC-7901/DDP分别接种于培养瓶，在其中加入5 ml RPMI1640完全培养基进行培养，当细胞生长达到85%融合生长，对总RNA进行Trizol试剂提取。

1.2.3 实时荧光定量PCR 分析转染前后SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞miRNA-Let-7b的表达水平，并进行验证，做好相应的记录。

1.2.4 转染效率测试 采用lipofectamineRNAimax对miRNALet-7b抑制物及阴性对照NC进行转染。

1.2.5 细胞凋亡检测 对细胞进行离心收集，在4℃环境下，采用PBS对细胞进行两次洗涤，除去上清液。混合均匀，在避光条件下孵育20 min左右，采用流式细胞以对细胞凋亡情况进行检测，并采用Mod-FitLTV3.0软件进行细胞凋亡分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 细胞株miRNA-Let-7b转染前后表达水平检测

转染前，miRNA-Let-7b在SGC-7901/DDP细胞中的表达水平低于在SGC-7901细胞中的水平，是SGC-7901细胞的（27.37±2.84）%（P＜0.05），转染48 h后，SGC-7901/DDP细胞miRNA-Let-7b表达水平是SGC-7901的（19.92±1.64）%，见图1。

图1 miRNA-Let-7b在SGC-7901细胞株及SGC-7901/DDP细胞中的起始表达量

2.2 miRNA-Let-7b对细胞顺铂药物敏感性的影响

SGC-7901转染Let-7b inhibitor后对顺铂的敏感性降低，细胞TC50值为0.604 μg/ml，95%可信区间为0.462～0.784 μg/ml，差异有统计学意义（P＜0.05），SGC-7901转染miRNA-Let-7b minmic后对顺铂的敏感性则得到了增强（P＜0.05），细胞TC50值为4.482 μg/ml，95%可信区间为4.052～4.763 μg/ml，见图2。

2.3 miRNA-Let-7b对细胞凋亡的影响

SGC-7901转染miRNA-Let-7b mimic后，SGC-7901/DDP为（13.52±0.362），细胞凋亡率增强，高于对照组的（3.654±0.153），差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

临床研究表明，对于胃癌晚期患者给予含铂双药标准化疗方案治疗总有效率仅为30%左右[3-4]，这很大程度上是因为患者对化疗药物的原发性或继发性耐药作用，因此，对铂类药物治疗敏感性的识别与抑制研究尤为重要。有学者在研究中发现肿瘤组织及细胞内存在一定数量的miRNA表达异常，其在基因转录后会对目标基因表达产生抑制作用，进而引起肿瘤细胞凋亡通路异常[5]。此次研究中着重探究了miRNA-Let-7b调控胃癌细胞顺铂化疗耐药的分子机理，结果显示，SGC-7901转染Let-7binhibitor后对顺铂的敏感性降低（P＜0.05），差异有统计学意义，SGC-7901转染miRNA-Let-7b minmic后对顺铂的敏感性则得到了增强（P＜0.05），说明miRNA-Let-7b在胃癌细胞中能够充当抑癌基因作用，其低表达会降低SGC-7901对顺铂的敏感性，相反，其高表达则会在一定程度上增强SGC-7901对顺铂的敏感性。另外，SGC-7901转染miRNA-Let-7b mimic后，细胞凋亡率明显增强，高于对照组（P＜0.05）。作为一种抑癌基因，miRNA-Let-7b能够对细胞增殖起到抑制作用，其表达水平变化直接影响到细胞凋亡及对顺铂的敏感性[6-8]。

综上所述，miRNA-Let-7b对胃癌细胞顺铂化疗耐药性具有调控作用，能够对细胞增殖起到抑制作用，可以为临床抗癌药物研发提供借鉴。

图2 miRNA-Let-7b对细胞顺铂药物敏感性的影响

[1] 郑晓辉，刘平． MiR-497对人胃癌细胞株顺铂耐药性的影响和机制[J]． 中国医院药学杂志，2016，36（3）：191-195．

[2] 张芳，李洋，吴蘅，等． MiR-192靶向负调控Bim表达诱导肺癌顺铂耐药[J]． 中国肺癌杂志，2014，17（5）：384-390．

[3] 骆海军，李丽丽，李伟，等． DNA修复相关基因甲基化与肺癌A549细胞顺铂化疗耐药的相关性研究[J]． 中华实用诊断与治疗杂志，2014，28（2）：122-124．

[4] 莫益俊，李道传，傅文凡，等． 非小细胞肺癌顺铂化疗耐药相关微RNA的筛选及鉴定[J]． 肿瘤研究与临床，2013，25（3）：160-165．

[5] 牛秀珑，陈晓，张晓雷，等． 内源性IL-8诱导卵巢癌细胞对顺铂与紫杉醇产生耐药的机制研究[J]． 免疫学杂志，2012，28（8）：645-650．

[6] 任丽，黄琛，柳雅慧，等． 微小RNA-21转染对人肺癌细胞株顺铂耐药性的影响及机制探讨[J]． 中华医学杂志，2016，96（18）：1454-1458．

[7] 董倩，蒋丽媛，陈虎． 顺铂联合热疗对人胃癌耐药细胞增殖及耐药相关基因GST-π影响的实验研究[J]． 中国现代医学杂志，2012，24（34）：14-17．

[8] 李滨，汪丽燕，蒋欢欢． Periostin过表达诱导人胃癌细胞化疗耐药性的机制研究[J]． 胃肠病学，2013，18（12）：728-732．

Molecular Mechanism of miRNA-Let-7b Regulating Chemotherapy Resistance in Cisplatin of Gastric Cancer Cells

HAN Xiao ZHANG Jingjing HAN Zhengquan Internal Medicine-

Oncology Department, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233000, China

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of miRNA-Let-7b regulating chemotherapeutic drug resistance in cisplatin of gastric cancer cells.MethodsThe expression of miRNA-Let-7b was detected by RT-PCR in gastric cancer cell line SGC-7901, and the expression of miRNA-Let-7b in gastric cancer cells was detected. The cell proliferation, The situation of the comprehensive analysis. Results The expression level of miRNA-Let-7b in SGC-7901 / DDP cells was (27.37 ± 2.84)% (P ＜ 0.05), which was statistically significant. SGC-7901 transfected with Let-7b inhibitor (P ＜ 0.05). The sensitivity of SGC-7901 transfected miRNA-Let-7b minmic to cisplatin was significantly increased (P ＜ 0.05); SGC-7901 transfected miRNA The apoptosis rate was significantly higher than that of the control group (P＜ 0.05), and the apoptosis rate was significantly higher than that of the control group (P ＜ 0.05).ConclusionThe decrease of miRNA-Let-7b expression can accelerate the proliferation of gastric cancer cells and inhibit the apoptosis of gastric cancer cells, and reduce the sensitivity of gastric cancer cells to cisplatin, which can provide reference for the development of clinical anticancer drugs.

miRNA-Let-7b; gastric cancer cell; cisplatin; drug resistance; molecular mechanism

735．2；R730．53

A

1674-9316（2017）06-0064-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．06．038

miRNA-let-7b逆转胃癌顺铂耐药性的作用及分子机制研究（课题编号1608085MH201）

蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科，安徽 蚌埠 233000

韩正全