基于酸性磷酸脂酶和淀粉酶活性测定的浙贝母道地性研究

2017-04-24水豪杰王井玲

浙江中医杂志 2017年4期

关键词：浙贝母磷酸酯麦芽糖

水豪杰王井玲

1 浙江省宁波市鄞州区第二医院浙江宁波 315100 2 浙江中医药大学浙江杭州 310053

基于酸性磷酸脂酶和淀粉酶活性测定的浙贝母道地性研究

水豪杰王井玲

1 浙江省宁波市鄞州区第二医院浙江宁波 315100 2 浙江中医药大学浙江杭州 310053

目的：比较不同产地浙贝母的酸性磷酸脂酶（ACP）和淀粉酶(AMY)活性。方法：采用对硝基酚比色法测定ACP活性，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定AMY活性，采用聚类分析方比较研究不同产地浙贝母ACP和AMY活性。结果：不同产地浙贝母的ACP和AMY活性存在较大差异，磐安冷水产的浙贝母两酶活性最高，而江苏浙贝母两酶最低。结论：ACP和AMY活性比较研究可作为浙贝母来源鉴定的依据之一。

浙贝母酸性磷脂酸酶对硝基酚比色法淀粉酶 3,5-二硝基水杨酸聚类分析

浙贝母是百合科植物浙贝母Fritillatia thunbergii Miq.的干燥鳞茎，是浙江的道地药材。目前，市场上的浙贝母多来源于浙江鄞州、新渥等地，江苏、安徽等浙江附近省会也有生产。不同产地浙贝母药用价值有显著差异，但至今还未见关于不同产地浙贝母酸性磷酸酯酶（ACP）和淀粉酶（AMY）活力比较研究方面的报道。本文比较来源于冷水、新渥、永康、缙云、东阳、龙观、鄞州、章村、江苏等9个不同产地浙贝母中ACP和AMY的活性，以期为浙贝母来源鉴定提供依据。

1 实验材料

1.1 材料：样品浙贝母购于冷水、新渥、永康、缙云、东阳、龙观、鄞州、章村、江苏等9个不同地区；经浙江中医药大学药学院俞冰老师鉴定，均为百合科贝母属植物浙贝母的干燥鳞茎，符合中国药典2015年版的规定。

1.2 仪器与试剂：分述如下。

1.2.1 仪器：KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JH-09-03紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂制造）；BCD-216F伊莱克斯冰箱（湖南长沙伊莱克斯电器有限公司）。

1.2.2 试剂：三羟甲基氨基甲烷（生化试剂，批号：F20090611，国药集团化学试剂有限公司），对硝基酚（分析纯，批号：20120329，上海凌风化学试剂有限公司），麦芽糖(生化试剂，批号：20090305，上海伯奥生物科技有限公司)，淀粉(分析纯，批号：20110325，上海申汕实业有限公司)，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 供试样品的制备：取浙贝母样品洗净，称重后匀浆，加入10mmol·L-1Tris HCl缓冲液（含0.15mol·L-1NaCl，pH7.4）100ml，置4℃下浸提24h，4600r·min-1离心30min，吸取上清液lml，10000r·min-1离心5min，上清液0.22μm滤膜滤过，即得测定用样品，放入4℃冰箱储存。

2.2 酸性磷酸酯酶活力测定：分述如下。

2.2.1 对硝基酚标准曲线的绘制：取7支干净的具塞刻度试管，编号，分别取对硝基酚标准溶液（60μmol·L-1）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml依次加入到试管中，用0.02mol·L-1NaOH补至6ml，混匀。以1号管作为空白调零点，在405nm波长下测定各管吸光度。以对硝基酚含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.2 酶活力测定：将样品用蒸馏水配制成浓度为0.1mg·ml-1的酶液，取0.5ml 0.02mol·L-1对硝基苯磷酸二钠，1.5ml pH4.6乙酸缓冲液，于试管中混合后，在37℃预热5min，加入0.5ml酶液，立即混匀并记时，37℃准确保温20min，加入lml 0.5mol·L-1NaOH终止酶反应，以先加入NaOH后再加酶液作为空白，然后于405nm处测吸光度。

2.2.3 不同产地酸性磷酸酯酶活力值：根据吸光度在对硝基酚标准曲线上查出相应的对硝基酚含量。一个酶活力单位定义为：单位时间内（1min）每毫升酶液反应产生1nmol对硝基酚为1个酶活力单位。

2.3 淀粉酶活力测定：分述如下。

2.3.1 麦芽糖标准曲线测定：取7支干净的具塞刻度试管，编号，分别取麦芽糖标准溶液(1mg·ml-1)0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml依次加入到试管中，用蒸馏水补足至2ml，向各试管中加入2ml DNS，摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20 ml。以l号管作为空白调零点，在540nm波长下测定吸光度。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3.2 酶活力测定：取测定样品用蒸馏水配制成浓度为0.02mg·ml-1的酶液，取1ml酶液，置于40℃恒温水浴中保温10min，加入lml 1%淀粉溶液，在40℃恒温水浴中准确保温5min，加入2ml DNS，在沸水浴中加热5min，迅速用冷水冲洗冷却，加蒸馏水定容至20ml，以第一次保温前加入DNS试剂作为对照，540nm处测吸光度。

2.3.3 不同产地淀粉酶活力值：根据吸光度在麦芽糖标准曲线上查出相应的麦芽糖含量，淀粉酶活力以单位时间内(1min)每毫升酶液催化反应所得1mg麦芽糖为一个酶活力单位。比活力为每毫克蛋白所含的酶活力单位数。

2.4 数据分析：对9个产地样品进行分析。取不同产地浙贝母的酸性磷酸酯酶酶活力平均值作为变量，运用SPSS l8.0软件对其进行系统聚类分析。

3 结果与分析

3.1 对硝基酚标准曲线绘制：以对硝基酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程以及相关系数R2，y=0.0182x-0.0019，R2=0.9998吸光度在0～0.36A范围内线性关系良好。

3.2 麦芽糖标准曲线绘制：在540nm处测定吸光度值下，以吸光度(y)对浓度(x)进行线性回归，得回归方程y=5.2422x+0.001，R2=0.9994。实验结果表明，麦芽糖在0.0～0.1mg/ml浓度范围内与吸光度线性关系良好。

3.3 不同产地浙贝母的酸性磷酸酯酶活力值比较：见表1。不同产地浙贝母中酸性磷酸酯酶活力大小均有差异，冷水地区活力最高，江苏地区活力最低，冷水地区浙贝母的酸性磷酸酯酶最大活力值是江苏地区的最小活力值的近两倍。

表1 不同产地浙贝母的酸性磷酸酯酶活力值

3.4 不同产地浙贝母的淀粉酶活力值比较：见表2。不同产地浙贝母中淀粉酶活力大小均有差异，冷水浙贝母活力最高，江苏活力最低。冷水和新渥以及永康在数值上较为接近，缙云、东阳、龙观、鄞州的浙贝母活力值相近。

表2 不同产地浙贝母淀粉酶活力值

3.5 聚类分析：9个样品大致可以分为4类（见图1）。冷水、新渥地区浙贝母样品聚为Ⅰ类，两者样品中2种酶的活力最大。缙云、永康、东阳地区浙贝母样品聚为Ⅱ类。龙观、章村、鄞州地区浙贝母样品聚为Ⅲ类，主要是这些样品中3种酶的活力均接近，活力较低。江苏地区浙贝母样品单独聚为Ⅳ类，与其他3类距离最远，其酶活力明显低于其他3类。以上结果可以为浙贝母来源鉴定提供依据。