注射式脱钙骨基质修复大鼠颅骨缺损的研究

李矛 沈亚俊 赵彦涛 侯树勋

注射式脱钙骨基质修复大鼠颅骨缺损的研究

李矛 沈亚俊 赵彦涛 侯树勋

目的通过改良脱钙方法制备注射式脱钙骨基质 ( demineralized bone matrix，DBM )，对其理化性质和修复骨缺损能力进行观察评估。方法 采用改良的动态脱钙和二次换酸等工艺制备 DBM，通过扫描电镜对其表面形貌进行观察，连续光源原子吸收光谱仪测定钙含量，利用赋形剂将 DBM 颗粒制备成可注射式 DBM。在大鼠颅骨缺损模型中，分别植入传统方法制备的注射式 DBM 1 和改良方法制备的 DBM 2，并设定空白对照组。在术后 4 周和 8 周分别将大鼠颅骨取材，通过 Micro-CT 影像学检查以及组织病理切片来观察颅骨缺损部位骨修复情况，对新生骨进行定量比较。结果 改良脱钙的 DBM 2 与传统方法制备的 DBM 1 相比，其表面形貌无明显改变，钙含量百分比均明显低于行业要求的标准值。术后 4 周和 8 周的 Micro-CT 提示：DBM 2 组新骨形成量为 ( 4.6±0.8 ) mm3和 ( 7.6±1.4 ) mm3，百分比为 ( 30.5±5.3 ) % 和 ( 51.4±9.5 ) %；DBM 1组新骨形成体积为 ( 3.6±0.6 ) mm3和 ( 6.2±0.9 ) mm3，百分比为 ( 23.8±4.0 ) % 和 ( 41.9±6.1 ) %；空白组新骨形成体积为 ( 1.3±0.4 ) mm3和 ( 2.1±0.8 ) mm3，百分比为 ( 8.6±2.6 ) % 和 ( 14.2±5.4 ) %，DBM 2 组明显优于DBM 1 组和空白组 ( P＜0.05 )。术后 8 周的 HE 染色提示：DBM 2 组中新生骨的形成量明显多于 DBM 1 组和空白组。结论 利用动态脱钙等改良工艺制备的注射用 DBM 2 较传统方法制备的 DBM 1，更有利于修复骨缺损，工艺耗时短，更有利于工业化生产。

脱钙技术；大鼠；颅骨；脱钙骨基质

由创伤、肿瘤术后、感染等因素导致的骨缺损，会进一步引起肢体的功能障碍，影响患者的生活质量，长时间的反复治疗也增加了患者的经济和时间成本。解决这一难题的主要治疗方法是进行骨移植促进骨修复再生，其中自体骨移植是金标准。但由于自体取骨数量有限且易发生供区术后疼痛等并发症，其临床应用受到限制[1-3]。同种异体骨来源丰富，不受形态、大小限制，因而需求量日益增大，其研究和应用也日趋活跃，并大量应用于临床[4-5]。骨库常采用松质骨制备同种异体植骨材料而皮质骨材料不能被很好地利用，为了解决皮质骨的利用问题，本课题组一直进行相关研究和工艺改进。同种异体皮质骨通过脱钙处理，可以解除钙对骨形态发生蛋白 ( bone morphogenetic protein，BMP )及其它成骨因子的包绕，更有利于诱导骨形成，其临床应用效果接近冻干松质骨的骨愈合率[6]。在DBM 制备过程中，脱钙是关键[7]，传统脱钙对皮质骨的酸处理以及去酸处理的时间长，容易导致蛋白活性的损失，影响 DBM 的骨诱导活性[8]。本课题组采取动态的脱钙和二次酸处理脱钙，利用离心机快速清洗脱酸等一系列工艺处理，制备 DBM ( 北京鑫康辰医学科技发展有限公司提供 )，可以明显缩短工艺流程时间[9-10]。本研究拟对改良脱钙方法制备DBM 的骨修复能力进行评估，为临床应用和产业化进程提供实验依据。

材料与方法

一、两种方法制备 DBM

严格筛选的供体经过 4 周的深低温处理、解冻，去除软组织，切割成利于加工的小块，超声清洗脱脂，冷冻干燥 72 h。加入粉碎机中，筛选出150～700 μm 粒径的颗粒，利用不同方法制备 DBM。本课题组前期通过传统方法和改良方法分别制备出DBM 1 ( 传统方法 ) 和 DBM 2 ( 改良方法 )[9]。

其中传统方法采用 0.5 mol / L 的盐酸溶液，按稀盐酸与骨质重量比 40∶1 的比例静止条件下进行脱钙，脱钙后 3 天，进行 5 次超声水浴清洗，每次1 h，共需 5 h。清洗后需小心弃去上清，防止过多DBM 流失，将收集的 DBM 装入灭菌袋中，展平放入 -20 ℃ 冰箱预冻，-40 ℃，＜0.01 kPa ( 1 mm Hg＝0.133 kPa ) 真空条件下冷冻干燥 72 h。聚乙烯塑料袋分装，3 层密封，60Co 辐照灭菌，剂量 25 kGy。

改良方法按稀盐酸与骨质重量比 20∶1 的比例，加入容器内置于恒温振荡器上，25 ℃ 条件下20 r / min 的速度进行脱钙反应后 1 h 重新换酸继续振荡，再经过 1 h 的反应后，用 20 倍体积水在1000 r / min 的离心速度下漂洗 15 min，弃去上清，重新加水离心重复 5 次共 75 min。清洗后即刻将DBM 装入灭菌袋中，展平放入 -20 ℃ 冰箱预冻，准备上冻干机。-40 ℃，＜0.01 kPa 真空条件下冷冻干燥 72 h。聚乙烯塑料袋分装，3 层密封，60Co 辐照灭菌，剂量 25 kGy。

二、DBM 扫描电镜观察及元素分析

将通过传统脱钙和改良脱钙方法制备的 DBM 1和 DBM 2 分别干燥，喷金，扫描电镜观察其表面形貌。分别取 DBM 1 和 DBM 2 样品，使用 MOS ( metaloxide-semiconductor ) 级的硝酸和盐酸混合溶液 ( 按1∶1 体积配制 ) 溶解，随后取出测定溶液，利用连续光源原子吸收光谱仪测定钙离子质量，并计算钙含量百分比。

三、大鼠颅骨缺损模型的建立及应用

动物实验选取 30 只成年 ( 10～12 周，300～350 g ) 雄性 SD 大鼠 ( 解放军总医院第一附属医院动物中心提供并饲养 )，所有实验动物均严格按照标准进行饲养，所有动物实验均在获得解放军总医院第一附属医院动物伦理委员会批准后进行。随机分组30 只大鼠并称量体重，3% 戊巴比妥钠溶液 ( 0.15～0.2 ml / 100 g ) 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后大鼠取俯卧位，并固定于固定板上，手术区域备皮，消毒 ( 图 1a )，铺无菌手术巾，戴无菌手套。沿颅骨顶正中线纵向切开长约 3 cm 切口，依次切开皮肤、皮下组织，仔细分离骨膜 ( 图 1b，c )，在双侧顶骨区域的正中位置，采用直径为 5 mm 的磨钻小心钻磨颅骨同时用探针探查深度，当颅骨接近钻透时，可用小镊子进行钝性撬拨，将骨片完全取下，避免损伤下方的硬脑膜和其表面血管 ( 图 1d，e，f，g )。在缺损处分别放置可注射式 DBM 1 ( 传统脱钙方法制备 )，可注射式 DBM 2 ( 动态脱钙 )，以及空白组 ( 不放置材料 )，缺损处骨膜下方和硬脑膜上方分别放置纤维素膜 ( 图 1h )。充分止血，依次缝合各层组织，关闭伤口后碘伏消毒切口 ( 图 1i )，术中注意观察大鼠呼吸、心率等生命体征。术后待大鼠麻醉苏醒后，耳标标记所有大鼠并将其分笼词养，术后连续3 天颈部皮下注射青霉素 20 万 U / 天。手术过程中有 3 只大鼠死亡，均予以及时补充。

四、术后动物大体观察

术后观察所有动物的一般情况，如饮食、体重、排泄、运动等以及伤口愈合情况，有无并发症。

五、术后影像学观察

术后 4 周和 8 周，处死大鼠后，将大鼠频骨完整取出，利用 Mciro-CT 系统 ( Siemens，Munich，Germany ) 扫描并行三维重建，观察成骨情况。扫描条件：电压 80 kVp，电流 500 mA，利用分析软件( Cobra EXXIM，EXXIM Computing Corp.， Livermore，CA ) 进行定量分析，选取的定量观察区域为直径 5 mm，厚度 1.5 mm。

六、组织学分析

术后 8 周取材，将大鼠颅顶骨固定于 10% 多聚甲醛固定液后 24 h，用 15% EDTA ( pH 7.2～7.4 ) 室温下摇床震荡脱钙 2～3 周。常规石蜡包埋、切片( 厚度 5 μm )。对切片进行苏木精－伊红 ( HE ) 染色，于光镜下观察颅骨缺损部位的愈合情况。

七、统计学处理

图1 可注射式 DBM 1 和 DBM 2 应用于大鼠颅骨缺损修复Fig.1 The injectable DBM 1 and DBM 2 were applied in the rat calvarial defect model

结 果

一、材料表征观察

通过扫描电镜，观察 DBM 1 和 DBM 2 表面形貌，发现皮质骨颗粒表面孔隙较小 ( 1～2 μm )，两者无明显差别 ( 图2 )。通过连续光源原子吸收光谱仪测定钙含量百分比分别为 ( 0.3±0.1 ) % 和 ( 0.5±0.2 ) % ( 表1 )。制备成注射式 DBM 后，两者的可注射性较强，有一定的韧性，但机械强度较差。

图2 两种 DBM 的扫描电镜观察及制备成可注射式 DBM 的大体照片 a：DBM 1 的大体照片；b：DBM 1 的表面形貌；c：DBM 2 的大体照片；d：DBM 2 的表面形貌 ( 红色箭头部分为 DBM 表面的孔隙结构 )Fig.2 The surface topography of DBM 1 and DBM 2 through the SEM, and the photographs of the injectable DBM 1 and DBM 2 a: The photograph of the injectable DBM 1; b: SEM of the DMB 1 showed the pore ( red arrow ); c: The photograph of the injectable DBM 2; d: SEM of the DMB 2 showed the pore ( red arrow )

表1 两种 DBM 钙含量测定结果 ()Tab.1 The calcium content of the DBM 1 and DBM 2 ()

表1 两种 DBM 钙含量测定结果 ()Tab.1 The calcium content of the DBM 1 and DBM 2 ()

分组 钙含量百分比 ( % ) 标准值DBM 1 0.3±0.1 ＜6 DBM 2 0.5±0.2 ＜6

二、术后大鼠一般情况

术后所有大鼠饮食、排泄、活动正常，术后前3 天体重较术前有所下降，随之逐渐上升，3 组间无显著差异。大部分伤口愈合良好，未出现感染、渗血、红肿、渗液等情况，2 只老鼠伤口有红肿和少量渗液，术后 10 天时都恢复正常。所有大鼠无肢体无力，抽搐等并发症，无死亡。

三、术后影像学和组织学观察 ( 图3、4 )

术后 4 周和 8 周的 Micro-CT 提示，DBM 2组的骨修复最好，新骨形成较多，新骨形成体积为 ( 4.6±0.8 ) mm3和 ( 7.6±1.4 ) mm3，百分比为( 30.5±5.3 ) % 和 ( 51.4±9.5 ) %；DBM 1 组中骨缺损部分修复，新骨形成体积为 ( 3.6±0.6 ) mm3和 ( 6.2±0.9 ) mm3，百分比为 ( 23.8±4.0 ) % 和( 41.9±6.1 ) %；空白组中骨修复最差，仅有少量新骨形成，新骨形成体积为 ( 1.3±0.4 ) mm3和 ( 2.1± 0.8 ) mm3，百分比为 ( 8.6±2.6 ) % 和 ( 14.2± 5.4 ) %。术后 8 周 HE 染色低倍镜下可观察到缺损边缘清晰，有少量新骨生成，在缺损中央区域，空白组基本无新骨形成，只有纤维结缔组织连接；在DBM 2 和 DBM 1 组中，缺损中央区域可看到未被吸收的 DBM，高倍镜下可观察到在其周围有大量的新生骨组织。

图3 术后 4 周和 8 周颅骨缺损的影像学观察 a：空白组 4 周；b：DBM 1 组 4 周；c：DBM 2 组 4 周；d：空白组 8 周；e：DBM 1 组8 周；f：DBM 2 组 8 周；定量分析表明，DBM 2 组中的新骨形成量明显多于 DBM 1 组Fig.3 Evaluation of mineralization in the calvarial defect via micro-CT showed mineralized bone formation at 4 and 8 weeks after the surgery a - c: At 4 weeks, the control group, the DBM 1 group and the DBM 2 group; d - f: At 8 weeks, the control group, the DBM 1 group and the DBM 2 group. The quantification analysis showed more new bone formed in the DBM 2 group when compared with the DBM 1 group

讨 论

DBM 具有良好的骨诱导能力，从 1965 年Urist[11]报道以来，国内外的众多学者通过实验研究已经明确了 DBM 的骨诱导能力，其主要是 DBM中的 BMP 和 β 转化生长因子 ( transforming growth factor，TGF-β )、成纤维细胞生长因子 ( fibroblast growth factor，FGF )、胰岛素样生长因子 ( insulinlike growth factor，IGF-1 ) 等细胞因子成分的协同作用，诱导间充质细胞分化为软骨细胞及成骨细胞，进而形成软骨组织和骨组织[11-12]。

图4 大鼠术后 8 周组织学观察 ( a～c HE × 40，e～f HE × 200 ) a、d：空白对照组；b、e：可注射式 DBM 1；c、f：可注射式 DBM 2；( a，b，c 比例尺为 1000 μm；d，e，f 比例尺为 100 μm ) NB：新生骨；DBM：DBM 1 / DBM 2Fig.4 H&E histological staining for the samples from the rat calvaria defect model at 8 weeks after the surgery a, d: The control group; b, e: Injectable DBM 1; c, f: Injectable DBM 2; ( a, b, c: scale bar, 1000 μm; d, e, f: scale bar, 100 μm ). NB: newly formed bone; DBM: DBM 1 / DBM 2

DBM 的传统制备过程中，一般采用盐酸在静止状态下进行脱钙，通常持续 3～5 天，然后再进行长时间的超声水浴清洗。这种制备方法不仅耗时，而且在清洗过程中由于水温的变化等原因，容易出现蛋白损失，从而降低 DBM 的成骨活性[8]。本课题组改良的制备方法，通过采用动态脱钙工艺和 2 次酸化处理工艺进行脱钙，然后利用离心机快速清洗脱酸。在缩短制备时间的同时，可以减少制备过程中蛋白的丢失，更有利于 DBM 的产业化生产。裸鼠肌间隙的异位成骨实验显示改良方法制备的 DBM 其骨诱导活性明显高于传统方法[9]。

临床上需要处理的大量骨缺损，通常形态不规则。目前常用的颗粒或棒状植骨材料填充植骨，难免会出现颗粒脱落或残留死腔，从而导致异位成骨和骨缺损治疗失败。可注射骨修复材料可根据不同骨缺损形态而进行术中塑型，修复骨缺损，具有塑形好、组织损伤小、操作简便、手术并发症少等优点[13-14]。研究人员选取了很多材料将 DBM 进行赋型，如纤维蛋白胶、明胶、胶原等[15-18]。本课题组利用氯化钠溶液溶胀明胶，再复合甘油以获得均匀、可注射的赋形剂材料[19-20]。由于氯化钠可以改变明胶蛋白分子的结构特征，显著增加此材料的黏度和稳定性，即使在超过 20 kGy 的剂量辐照灭菌之后，黏度下降不超过 30%，可满足比重较大的药物或功能材料 ( 8.9＞密度 P＞1.0 ) 的注射赋形需要。

在本实验的大鼠颅骨缺损修复模型中，改良脱钙工艺制备的 DBM 2 较传统工艺制备的 DBM 1，其表面形貌、元素组成和含量比差异无统计学意义；而影像学和组织学的结果提示，DBM 2 相较于DBM 1 在大鼠颅骨缺损修复过程中，能够更好的促进骨缺损的修复。这说明改良方法制备的 DBM 2 较传统方法制备的 DBM 1，其在保留 BMP、TGF-β、IGF-1 等细胞因子成分活性方面可能具有更大的优势，能够明显提高骨缺损的修复能力，而且其时间成本更低，更有利于产业化生产。

综上所述，通过改良脱钙方法制备的注射式DBM 能够明显促进骨缺损的修复，其工艺制备时间短，更有利于大规模产业化生产。

[1] Moga G. Bone grafts[J]. J Foot Surg, 1976, 15(4):125-127.

[2] Aichelmann-Reidy ME, Yukna RA. Bone replacement grafts[J]. The bone substitutes. Dent Clin North Am, 1998, 42(3): 491-503.

[3] Brunsvold MA, Mellonig JT. Bone grafts and periodontal regeneration[J]. Periodontol, 2000, 1993, 1(1):80-91.

[4] Urabe K, Itoman M, Toyama Y, et al. Current trends in bone grafting and the issue of banked bone allografts based on the fourth nationwide survey of bone grafting status from 2000 to 2004[J]. J Orthop Sci, 2007, 12(6):520-525.

[5] Kinney RC, Ziran BH, Hirshorn K, et al. Demineralized bone matrix for fracture healing: fact or fiction[J]? J Orthop Trauma, 2010, 24(Suppl 1):S52-55.

[6] 邱贵兴, 孙世荃. 同种异体骨植入材料的临床应用[J]. 中华骨科杂志, 2004, 24(10):635-637.

[7] Soicher MA, Christiansen BA, Stover SM, et al. Remineralization of demineralized bone matrix (DBM) via alternating solution immersion (ASI)[J]. J Mech Behav Biomed Mater, 2013, 26:109-118.

[8] Gruskin E, Doll BA, Futrell FW, et al. Demineralized bone matrix in bone repair: history and use[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2012, 64(12):1063-1077.

[9] 张春丽, 赵彦涛, 白玉龙, 等. 一种高效制备工艺对脱钙骨基质性能的影响[J]. 中国骨与关节损伤杂志, 2015, 30(1): 79-81.

[10] 衷鸿宾, 韩丽伟, 白玉龙, 等. 骨粉和脱钙液比例与脱钙时间对脱钙骨基质诱导成骨影响的研究[J]. 中国骨与关节杂志, 2015, 4(11):816-819.

[11] Urist MR. Bone: formation by autoinduction[J]. Science, 1965, 150(3698):893-899.

[12] Holt DJ, Grainger DW. Demineralized bone matrix as a vehicle for delivering endogenous and exogenous therapeutics in bone repair[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2012, 64(12):1123-1128.

[13] 程文俊, 金丹, 裴国献, 等. 可注射骨修复中国青山羊胫骨腔穴性骨缺损模型的建立与意义[J]. 南方医科大学学报, 2010, 30(1):35-37.

[14] Gupta R, Pandit N, Malik R, et al. Clinical and radiological evaluation of an osseous xenograft for the treatment of infrabony defects[J]. J Can Dent Assoc, 2007, 73(6):513.

[15] Shuang F, Hou SX, Zhao YT, et al. Characterization of an injectable chitosan-demineralized bone matrix hybrid for healing critical-size long-bone defects in a rabbit model[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18(5):740-752.

[16] Tian M, Yang Z, Kuwahara K, et al. Delivery of demineralized bone matrix powder using a thermogelling chitosan carrier[J]. Acta Biomater, 2012, 8(2):753-762.

[17] Vaccaro AR, Stubbs HA, Block JE. Demineralized bone matrix composite grafting for posterolateral spinal fusion[J]. Orthopedics, 2007, 30(7):567-570.

[18] Hamadouche M, Karoubi M, Dumaine V, et al. The use of fibre-based demineralised bone matrix in major acetabular reconstruction: surgical technique and preliminary results[J]. Int Orthop, 2011, 35(2):283-288.

[19] 李忠海, 赵彦涛, 侯树勋. 新型甘油基溶胶凝胶赋形材料: 性能及体内评价[J]. 中国组织工程研究, 2015(53):8637-8638.

[20] 赵彦涛, 韩丽伟, 白玉龙. 一种耐受辐照灭菌的高粘度注射赋形剂及其制备方法: CN 104436198 A[P/OL]. 2015-03-25[2017-01-10]. http://soopatooml patentl 20140643147.

( 本文编辑：李慧文 )

Research on the injectable demineralized bone matrix for the calvarial bone defect in a rat model

LI Mao, SHEN Ya-jun, ZHAO Yan-tao, HOU Shu-xun. Department of Orthopedics, Xijing Hospital, the fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China Corresponding author: HOU Shu-xun, Email: hsxortho@hotmail.com

Objective To obverse and evaluate the physicochemical properties and ability to repair bone defects of injectable demineralized bone matrix ( DBM ) prepared by a modified decalcification technique. Methods The DBM was prepared by the modified dynamic decalcification and double circle acid treatment method. The surface topography and composition were observed through a scanning electron microscope ( SEM ). And a continuum-source atomic absorption spectrometry ( CS-AAS ) was used to determine the samples’ calcium content. The injectable DBM was prepared from DBM granules by using the excipient. We implanted the DBM 1 ( the traditional method ) and DBM 2 ( the modified dynamic decalcification and double circle acid treatment method ) into the rat calvarial defect model. A blank control group was set. Rats were euthanised at 4 and 8 weeks after the operation. The repair effects of rat calvarial defects were evaluated by micro-computed tomography and histological analyses, with quantitative comparison of the new bone. Results There were no obvious differences in the surface topography and composition between the DBM 1 and DBM 2. The calcium content was significantly lower than the standard value. The microcomputed tomography analyses consistently revealed that the bone volume of newly formed bone ( BV-NFB ) and the percentage of the BV-NFB were ( 4.6 ± 0.8 ) mm3, ( 30.5 ± 5.3 ) % ( 4 w ) and ( 7.6 ± 1.4 ) mm3, ( 51.4 ± 9.5 ) % ( 8 w ) in the DBM 2 group; ( 3.6 ± 0.6 ) mm3, ( 23.8 ± 4.0 ) % ( 4 w ) and ( 6.2 ± 0.9 ) mm3, ( 41.9 ± 6.1 ) % ( 8 w ) in the DBM 1 group; ( 1.3 ± 0.4 ) mm3, ( 8.6 ± 2.6 ) % ( 4 w ) and ( 2.1 ± 0.8 ) mm3, ( 14.2 ± 5.4 ) % ( 8 w ) in the blank control group. The DBM 2 group was superior to both the DBM 1 group and the blank control group ( P ＜ 0.05 ).The histological analyses at 8 w after the operation indicated the more new bone formed in the DBM 2 group than the DBM 1 group and the blank control group. Conclusions The DBM 2 prepared by the modified dynamic decalcification and double circle acid treatment method shows excellent osteogenic capacity when compared with the DBM 1 prepared by the traditional method, which takes a shorter time and is conducive to industrial production.

Decalcification technique; Rats; Skull; Demineralized bone matrix

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.04.011

R318

国家自然科学基金项目 No. 81672130；军事医学项目 13CXZ028，AWS14C007；北京市自然科学基金 7152144；北京市科技新星项目 Z1511000003150134；临床部项目 2014ZD001

710032 西安，第四军医大学西京医院 ( 李矛、沈亚俊 )；100048 北京，解放军总医院第一附属医院、北京市骨科植入医疗器械工程技术研究中心、全军骨科研究所李矛 ( 赵彦涛、侯树勋 )

侯树勋，Email: hsxortho@hotmail.com

2017-01-16 )