清胰Ⅱ号颗粒剂对急性重症胰腺炎大鼠胰腺损伤的保护作用

肖青川 兰天罡 兑丹华

(1 武警四川总队医院肝胆一外科，乐山，614000； 2 遵义医学院附属医院肝胆胰外科，遵义，563003)

清胰Ⅱ号颗粒剂对急性重症胰腺炎大鼠胰腺损伤的保护作用

肖青川1兰天罡2兑丹华2

(1 武警四川总队医院肝胆一外科，乐山，614000； 2 遵义医学院附属医院肝胆胰外科，遵义，563003)

目的：观察清胰Ⅱ号颗粒剂对重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)大鼠胰腺损伤的保护作用并探讨其机制。方法：将18只SD大鼠随机等分为假手术组(A组)、SAP组(B组)、治疗组(C组)。以30 g/L牛磺胆酸钠逆行注入胰胆管制作大鼠SAP模型。C组以250 g/L清胰Ⅱ号颗粒剂灌胃给药(10 mL/kg)，1次/6 h，A组、B组用同等剂量生理盐水以相同方式灌胃。制模后24 h取材，用real-time PCR检测胰腺组织中Hmgb1 mRNA表达，ELISA测定胰腺组织中一氧化氮和内皮素-1浓度，同时观察胰腺组织病理改变，测定胰腺组织湿/干重比值。结果：B组有胰腺组织损伤改变，Hmgb1 mRNA的表达上调，一氧化氮和内皮素-1浓度升高；清胰Ⅱ号颗粒剂可下调胰腺组织中Hmgb1mRNA的表达，降低一氧化氮及内皮素-1浓度，减轻胰腺病理损害程度。结论：Hmgb1、一氧化氮及内皮素-1在SAP胰腺损伤中可能具有重要作用，清胰Ⅱ号颗粒剂可能通过下调胰腺组织中Hmgb1 mRNA的表达，降低一氧化氮和内皮素-1浓度，减轻胰腺组织的病理改变，从而保护胰腺损伤。

高迁徙率族蛋白-1；内皮素-1；一氧化氮；重症急性胰腺炎；大鼠

重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)发生时，首要出现的是胰腺自身的病理生理变化，包括胰腺的充血、水肿、出血及坏死，内外分泌功能的紊乱等，胰腺损伤是发生这些变化的基础。普遍认为SAP胰腺损伤发生机制是胰腺微循环障碍[1]。而多种炎性反应递质、细胞因子在胰腺微循环障碍中起重要作用。本实验通过观测清胰Ⅱ号颗粒剂干预措施下，SAP大鼠胰腺组织病理学变化、内皮素-1(endothelin-1，ET-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)浓度变化及胰腺组织中高迁徙率族蛋白-1(high mobility group box 1，Hmgb1)mRNA表达改变，探讨清胰Ⅱ号颗粒剂对SAP大鼠胰腺损伤是否有保护作用，及其可能的作用机制，以便为该药的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级SD大鼠18只，购自第三军医大学野战外科研究所动物室(动物质量合格证号SCXK-(军)2012008)，体质量150～200 g，雌雄不拘。

1.1.2 药物 牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)。清胰Ⅱ号颗粒剂(遵义医学院附属医院研制)。

1.1.3 试剂与仪器 大鼠ET-1、NO定量ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。反转录反应试剂、RNAiso Reagent、PCR反应试剂(大连宝生物工程有限公司)，荧光定量PCR仪器(iCycler iQ，Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用随机数字表法，将18只大鼠等分为假手术组(A组)、SAP组(B组)、治疗组(C组)。参照文献[2]的方法复制SAP模型：100 g/L水合氯醛注射腹腔麻醉大鼠，上腹正中切口进腹。

1.2.2 给药方法 A组进腹后仅翻动肠管即关腹；其余2组大鼠开腹后提起十二指肠，用血管夹分别夹住肝门部胰胆管和十二指肠端，向胰胆管内逆行缓慢注入30 g/L牛磺胆酸钠溶液2 mL/kg，时间1 min，后保持2 min再关腹。制模后1 h每组大鼠灌胃：A、B组喂饲生理盐水10 mL/kg，C组喂饲等量250 g/L清胰Ⅱ号颗粒剂。其后，重复灌胃1次/6 h。24 h后处死大鼠，取材检测各相关指标。

1.2.3 检测指标与方法 胰腺组织形态学观察和湿/干重比值测定：处死大鼠后，取胰腺组织做常规HE染色。采用盲法，由专人在光学显微镜镜下观察胰腺组织病理改变，并进行病理评分[3]。用吸水纸吸干新鲜胰腺组织水分，电子天平称量湿重。再置于干燥箱中，60 ℃干燥72 h，称量干重，计算湿/干重比值。胰腺组织中Hmgb1基因mRNA表达水平测定和相对定量分析：以real-time PCR法检测胰腺组织内Hmgb1及β-actin的mRNA表达水平[1]。以β-actin作为内参，引物上游序列：5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′，下游序列：5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′，产物长度104 bp(大连宝生物合成)。Hmgb1基因引物，上游序列：5′-TGGGAAACTGGAGCAAAACC-3′，下游序列：5′-ACCACAAGACACCCCTCACC-3′，产物长度123 bp。反应条件：预变性：95 ℃，10 sec，1个循环。PCR反应：95 ℃，5 sec，60.2 ℃(内参基因为61.6 ℃)，20 sec，40个循环。熔解曲线分析：55 ℃开始采集信号，60次。用Bio-rad公司提供的基因表达分析软件Genex.xls进行相对定量分析、处理数据。胰腺组织中ET-1和NO浓度的测定：取每组相同质量的胰腺组织进行匀浆，离心分离后取上清，-20 ℃保存。各样品中ET-1和NO的含量，依照大鼠ET-1、NO定量ELISA试剂盒中提供的方法分别进行检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。对数据进行正态性、方差齐性检验。符合正态分布且方差齐同，进行方差分析。差异有统计学意义，进而行两两比较的q检验。资料呈偏态分布或方差不齐，进行秩和检验，将数据经秩转换后，作两两比较的q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺组织形态学观察和病理学评分比较 光学电子显微镜下胰腺组织形态学观察：A组胰腺组织偶见炎性细胞浸润，无明显水肿、出血、坏死，腺泡结构完整。制模后的B组胰腺组织可见大量炎性细胞浸润，间质水肿、结构破坏，组织大片出血、坏死，腺泡肿胀。而清胰Ⅱ号颗粒剂干预后的C组胰腺组织炎性细胞浸润，间质水肿、出血、坏死及腺泡的破坏程度均较B组减轻。量化后的B组胰腺组织病理学评分高于A组(P<0.01)，C组胰腺病理学评分小于B组(P<0.05)。见表1。

2.2 胰腺组织湿/干重比值比较 3组中，B组胰腺组织湿/干重比值明显高于A组(4.84±0.23 VS 3.37±0.22，P<0.01)。而C组胰腺组织湿/干重比值明显低于B组(4.39±0.29 VS 4.84±0.23，P<0.01)。

2.3 其他各项指标检测 与A组比较，B组胰腺组织中Hmgb1 mRNA相对表达量显著上调(P<0.01)，ET-1、NO浓度均显著升高(均P<0.01)。与B组比较，C组胰腺组织中Hmgb1 mRNA相对表达量明显下调(P<0.01)，且ET-1、NO浓度均明显降低(均P<0.01)。见表1。

表1 各组胰腺组织病理学评分、NO及ET-1浓度、Hmgb1 mRNA相对表达量比较

注：**P<0.01 vs A组；△△P<0.01 vs B组；▲P<0.05 vs B组。

3 讨论

既往实验研究表明，在SAP的发生、发展过程中，由于胰腺组织微循环障碍进而导致的胰腺组织缺血损伤是一个重要因素[4]。SAP时，引发胰腺损伤的涉及因素众多，而胰腺组织局部体液因素的调节作用尤其重要。ET-1和NO是内皮细胞分泌的2种重要的血管活性物质。NO由L-精氨酸和分子氧在NO合酶的催化下生成。作为一种内源性血管舒张剂、炎性反应递质、血小板聚集抑制因子和神经递质，NO最主要的生物学功能是传递信息、舒张血管和细胞毒作用。有研究显示，NO可能主要通过扩张血管、提高胰腺血流量、改善胰腺微循环，以减轻SAP时胰腺的亚细胞器损害，特别是减轻对线粒体和溶酶体的氧化损伤[5]。同时，NO可以对抗异位胰蛋白酶原的激活，抑制胰腺内胰蛋白酶和血清脂肪酶活性，进而实现对胰腺的保护作用[6]。关于NO在SAP发病中的作用也有不同的认识。Hossam等[7]以蛙皮素诱发大鼠水肿型急性胰腺炎，观察到用L-NNA阻断内源性NO后，胰腺组织水肿减轻，同时代表血管通透性的Evans blue漏出减少，而NO底物L-精氨酸能逆转L-NNA的作用，因此，NO导致胰腺损伤的机制是增加了蛋白的渗出和血管通透性。在本实验中，我们发现，复制大鼠SAP模型后，胰腺组织中NO含量明显增高，反映胰腺组织损伤的病理学指标如湿干重比值、病理学评分明显改变，胰腺损伤明显，表明高浓度的NO可能介导了SAP时的胰腺损伤。ET-1是迄今发现的最强的长效缩血管物质。研究发现对ET-1反应最明显的血管是微动脉分枝部，ET-1可使其收缩甚至使血管腔完全闭塞，ET-1的血管选择性作用对调节微循环血流量具有重要意义[8]。还有动物研究显示，静脉注射ET-1可使胰腺血流量明显下降，而胰腺血流量明显增加则出现在给予选择性ET-1受体拮抗剂后，表明在胰腺组织缺血缺氧的损伤过程中ET-1发挥了重要作用[9]。目前认为，急性胰腺炎时，ET-1引发胰腺损伤的主要机制是：血管内皮细胞产生的ET-1使胰腺小动脉痉挛，胰腺供血不足，胰腺组织缺血，而缺血又可导致产生更多ET-1，从而形成急性胰腺炎性反应细胞因子ET-1正反馈的病理生理过程，这一恶性循环的直接后果就是加重胰腺组织的损伤[10]。在我们的研究中，也观察到，诱导大鼠产生SAP后，胰腺组织中ET-1的含量显著增加，胰腺损伤明显。而给予清胰Ⅱ号颗粒剂干预后，出现相反的变化。

急性胰腺炎时，一定浓度的ET-1可刺激NO产生增加。合适水平的NO通过对抗ET-1缩血管作用，改善胰腺微循环，减轻白细胞-内皮的相互作用等，对胰腺损伤有保护作用。而过多释放的NO不但对胰腺损伤无保护作用，反而会介导胰腺组织损伤的发生和发展：一是高水平的NO可引起血管过度扩张，血液瘀滞，组织氧利用减少，直接导致胰腺损伤发生；二是NO还有自由基性质的细胞毒性作用，促使胰腺组织损伤加重。

Hmgb1是一类广泛存在于真核细胞内的非组蛋白，在人体分布十分广泛。可在单核巨噬细胞、中性粒细胞、血小板、肝细胞等细胞核和细胞质中表达。在炎性反应发生时，由于其相对于IL、TNF-α等早期炎性反应递质出现的晚，而以晚期炎性反应递质著称。有研究显示，用纯化的Hmgb1加入巨噬细胞培养物中，可明显刺激NO、IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α的产生，且呈剂量依赖性[11]。这表明作为晚期炎性反应递质的Hmgb1，反过来又可以增加早期炎性反应递质的大量释放。近年的动物实验和临床研究都发现在急性胰腺炎发生时，体内的Hmgb1水平升高，且升高程度与疾病严重程度呈正相关，而用Hmgb1阻滞剂丙酮酸乙酯干预后，肝、肺、肾功能及胰腺、肺等病理组织学改变得到明显改善，病死率降低，表明Hmgb1是急性胰腺炎急性炎性反应和器官损伤的重要递质[12-14]。在我们的研究中亦发现，SAP发生后，胰腺组织中Hmgb1mRNA的表达明显上调。

清胰Ⅱ号颗粒剂是一种中药复方制剂，内含大黄、栀子、丹皮等主要成分。我们前期对SAP发病机制中相关细胞因子TNF-α、CD44、IL-1、IL-6、MCP-1等的作用进行了研究[15-17]，也观察到清胰Ⅱ号颗粒剂有抑制促炎性反应细胞因子TNF-α、CD44、IL-1、IL-6等释放的作用[18]。在本实验中，我们还发现，诱发大鼠SAP发生24 h后，胰腺组织湿/干重比值增加，胰腺炎性反应水肿、出血坏死明显，出现胰腺损伤，胰腺组织中NO、ET-1水平均升高，Hmgb1 mRNA表达上调。而经过清胰Ⅱ号颗粒剂干预后，胰腺湿/干重比值降低，胰腺病理组织学改变减轻，同时，SAP大鼠胰腺组织中的NO、ET-1水平降低，Hmgb1 mRNA表达下调。由此，我们推测清胰Ⅱ号颗粒剂对SAP胰腺损伤有保护作用，除了与降低NO、ET-1等炎性反应递质浓度有关外，还可能与下调胰腺组织Hmgb1 mRNA表达有关。但是，在这一过程中是否存在Hmgb1与NO及ET-1的协同作用，尚需进一步研究。

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(2016-07-31收稿 责任编辑：徐颖)

Protective Effects of Qingyi II Granules against Pancreas Injury in Rats with Severe Acute Pancreatitis

Xiao Qingchuan1, Lan Tiangang2，Dui Danhua2

(1DepartmentofHepatobiliarysurgery,SichuanArmedPoliceHospital,Leshan614000,China；2DepartmentofHepatobiliarysurgery，AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi563003,China)

Objective:To observe the effect and mechanism of Qingyi II Granules (QY) against the pancreas injury in rats with severe acute pancreatitis (SAP). Methods:Eighteen SD rats were randomly divided into fake operation group (group A), SAP group (group B) and treatment group (group C). The rat SAP model was made by retrograde injection of 30 g/L sodium taurocholate into pancreatic duct. Group C was treated with 250 g/L Qingyi Ⅱ Granule (10 mL/kg), once per 6 h, and group A and group B were treated with the same dose of saline in the same way. The expression of Hmgb1 mRNA in pancreatic tissue was detected by real-time PCR after 24 hours of modeling. The concentration of nitric oxide and endothelin-1 in pancreas was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The pathological changes of pancreas were observed and the wet/dry weight ratio of pancreas was measured. Results:There were pancreas injury changes in group B, besides, expression of Hmgb1 mRNA was up-regulated and the levels of nitric oxide and endothelin-1 were increased; Qingyi Ⅱ Granule may cause that the expression of Hmgb1 mRNA in pancreatic tissue, the levels of nitric oxide and endothelin-1 concentration were decreased, thus reduced the degree of pathological damage of the pancreas. Conclusion:Hmgb1, nitric oxide and endothelin-1 may play an important role in SAP pancreatic injury. Qingyi II granules may reduce the expression of Hmgb1 mRNA in pancreatic tissue and decrease the concentration of nitric oxide and endothelin-1 to reduce the pathological changes of pancreatic tissue, thus protecting the pancreas injury.

High migration rate family protein-1; Endothelin-1; Nitric oxide; Severe acute pancreatitis; Rats

贵州省省长专项资金项目(编号：黔省专合字(2008)106号)

肖青川(1974.09—)，男，硕士，主治医师，研究方向：肝胆胰基础与临床，Email：bedllxiao@163.com

兑丹华(1957.06—)，女，本科，教授，肝胆胰科主任，研究方向：胰腺炎，Email：ddh1975@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.042