黄连对糖尿病肾病大鼠肾脏NF-κB及PPAR-γ表达的影响

郭杨志 杜 娟 李向民 冯兴中 郭 伟

(1 首都医科大学附属北京世纪坛医院,北京,100038; 2 北京市昌平区中西医结合医院,北京,102208;3 内蒙古自治区乌海市蒙中医院,乌海,016000)

黄连对糖尿病肾病大鼠肾脏NF-κB及PPAR-γ表达的影响

郭杨志1杜 娟2李向民1冯兴中1郭 伟3

(1 首都医科大学附属北京世纪坛医院,北京,100038; 2 北京市昌平区中西医结合医院,北京,102208;3 内蒙古自治区乌海市蒙中医院,乌海,016000)

目的:观察黄连对糖尿病肾病大鼠肾脏病理、肾小球NF-κB及PPAR-γ mRNA的影响。方法:采用高脂饮食结合腹腔注射链脲佐菌素方法建立糖尿病SD大鼠模型,随机分为模型组、厄贝沙坦组[31.25 mg/(kg·d)]、黄连低、中、高剂量组[相当于人黄连饮片用量的83 mg/(kg·d)、500 mg/(kg·d)、1000 mg/(kg·d)],每组8只,另取8只正常大鼠作为对照,给药12周后,检测各组大鼠肾小球NF-κB及PPAR-γ mRNA表达水平及肾脏病理变化。结果:黄连各剂量组可显著降低大鼠肾脏NF-κB表达(P<0.05),黄连高剂量组及厄贝沙坦组可显著增强大鼠肾脏PPAR-γ mRNA表达(P<0.05),各用药组均有一定改善大鼠肾脏病变的作用。结论:黄连具有降低糖尿病肾病大鼠肾脏NF-κB表达及增强PPAR-γ mRNA表达的作用,可缓解肾脏病变。

糖尿病肾病;黄连;NF-κB;PPAR-γ

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病的主要微血管并发症之一,其以肾小球肥大、肾小球滤过率降低、肾小球外基质堆积和肾小球纤维化为主要病理特征[1],是导致我国终末期肾病的主要原因之一[2]。包括多种炎性反应因子参与的炎性反应在DN进展过程中发挥重要作用[3]。

过氧物酶体增殖体激活受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ)是PPAR核受体家族中的一员,其通过改善胰岛素抵抗并降糖、降低血压、调节细胞生长周期、抑制脂质在肾脏沉积、抗炎抗氧化等作用改善DN所致肾脏损伤[4]。核因子-κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)存在于多种组织细胞中,是炎性反应的关键调控因子,其通过上调多种炎性反应因子及前炎性反应因子表达,如肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor α,TNF-α)、单核细胞趋化因子-1(Monocyte Chemoattractant Protein 1,MCP-1)、细胞间黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule 1,ICAM-1)等,募集炎性反应细胞向肾小球浸润,诱发并加重肾小球炎性反应损伤,参与DN进展[5]。而在DN发病过程中,PPARγ可通过抑制NF-κB表达,减轻DN炎性反应损伤,发挥肾脏保护作用。

黄连是毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch.)、三角叶黄连(CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao)或云连(CoptisteetaWall.)的干燥根茎[6],具有“清热燥湿解毒”作用,广泛应用于表现为湿热证侯、火毒证侯的多种疾病。近年来部分中医临床工作者总结了以“郁、热、虚、损”为特点的糖尿病发病规律,并应用大剂量黄连治疗糖尿病,取得了一定疗效。而在实验研究中也证实了黄连所含盐酸小檗碱、巴马汀等具有一定降低血糖及改善糖尿病并发症的作用[7-8]。本研究以全成分提取的黄连配方颗粒为干预手段,选取具有肾脏保护作用的PPAR-γ及促进肾脏炎性反应损伤的NF-κB作为观察指标,对比不同剂量黄连配方颗粒对此二者的影响,为临床应用黄连干预DN提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性SD大鼠70只,体质量160～180 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号SCXK(京)2012-0001,全部饲养于首都医科大学附属北京世纪坛医院动物实验室(室温20～24 ℃,空气相对湿度50%～70%,昼夜循环12 h,自由进食)。

1.1.2 药物 黄连配方颗粒,基原为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎,购自北京康仁堂药业有限公司(批号:15005651),1 g黄连配方颗粒提取自10 g黄连饮片;厄贝沙坦片(安博维)购自赛诺菲(杭州)制药有限公司(批号:5A154);高脂饲料(66.75%普通饲料,20%蔗糖,10%猪油,3%蛋黄粉,1%胆固醇,0.25%胆酸钠)购自北京科澳协力饲料有限公司(批号:11002900017691)。

1.1.3 试剂与仪器 链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购自Sigma公司(货号:S0130);兔抗NF-κB p65(A)单克隆抗体(1∶100)购自Santa Cruz公司产品(货号:sc-109);超敏二步法免疫组化检测试剂(货号:PV-9001)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;超纯RNA提取试剂盒(货号:CW0581)、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(货号:CW0956)、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(货号:CW0744),均购自北京康为世纪生物科技有限公司;引物序列由上海英骏生物技术有限公司合成。ABI 7500型快速实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司生产。奥林巴斯BX51光学显微镜显微镜为日本奥林巴斯株式会社生产。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 SD大鼠适应性饲养1周后,随机分为正常对照组(n=8)和STZ诱导组(n=62),分别予普通饲料及高脂饲料。4周后,STZ诱导组腹腔注射新鲜配制的STZ溶液(35 mg/kg),正常对照组予等剂量的枸橼酸钠腹腔注射。STZ注射72 h及1周后,尾静脉采血测定空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG),2次FBG均超过16.7 mmol/L者为DM造模成功[9]。造模成功的DM大鼠40只随机分为模型组、厄贝沙坦组、黄连低、中、高剂量组,每组8只。

1.2.2 给药方法 厄贝沙坦组予31.25 mg/(kg·d)厄贝沙坦片(安博维)灌胃;黄连低、中、高剂量组分别予52 mg/(kg·d)、312.5 mg/(kg·d)、625 mg/(kg·d)黄连配方颗粒剂灌胃[折算为成人黄连饮片用量为:83 mg/(kg·d)、500 mg/(kg·d)、1 000 mg/(kg·d)]，连续给药12周[10]。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 HE染色 第12周末,所有大鼠腹腔注射水合氯醛(10 mg/kg)麻醉,手术剥离大鼠两侧肾脏,将去掉包膜的肾脏纵向剖开,留取包括肾髓质及肾皮质的完整扇形组织。左侧肾脏组织4%多聚甲醛固定、石蜡包埋切片(4 μm),常规HE染色,光学显微镜(×400)观察大鼠肾小球病理改变,使用JEDR 801D形态学图像分析系统软件采集图像。

1.2.3.2 免疫组化染色 取石蜡固定切片(4 μm)行免疫组织化学法观察肾小球NF-κB表达。步骤:脱蜡;高温高压法组织修复;3%过氧化氢孵育5～10 min,PBS冲洗,2 min×3次;滴加一抗,4 ℃冰箱过夜,PBS冲洗,2 min×3次;滴加二抗,37 ℃孵育30 min,PBS冲洗,2 min×3次;DAB显色,蒸馏水充分冲洗;DAB显色;苏木素复染细胞核,分化,返蓝;剃度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。每张切片在高倍镜(×400)下选取含有肾小球的6个连续不重复视野,以胞质或胞核出现金黄色或棕黄色颗粒为阳性信号,采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定平均积分光密度值(IOD/area),以平均值作为该大鼠的肾脏阳性产物平均积分光密度值。

1.2.3.3 实时荧光定量PCR检测肾脏PPAR-γ mRNA表达 取右侧肾组织肾皮质100 mg,按超纯RNA提取试剂盒说明书操作进行总RNA提取,以总RNA为模板,逆转录合成cDNA。采用Primer3.0及NCBI-primer设计软件设计基因cDNA上游及下游引物,由上海英骏生物技术有限公司合成引物。PPAR-γ引物序列上游:5′-CTCC AGCT GAAG CTGA ACCA-3′,下游:5′-AGATCTCCTGGAGCAGAGGG-3′,163 bp;内参β-actin引物序列上游:5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,下游:5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,150 bp;待测物相对定量测定采用常用的2-△△Ct法[11]。

2 结果

2.1 大鼠肾小球HE染色 HE染色可见正常组大鼠肾小球毛细血管球结构清晰,管腔无狭窄,肾小球滤过膜结构完整,未见增厚、皱曲,肾小管结构清晰,肾间质未见炎性反应细胞浸润。DN大鼠肾小球体积缩小、毛细血管球结构破坏,局部肾小球组织纤维化、玻璃样变,毛细血管腔明显狭窄,并有脂质物质沉积导致滤过膜增厚,肾小管萎缩,肾间质血管增生。经厄贝沙坦及黄连低、中、高剂量干预后,大鼠肾小球病变均有改善,肾小球结构尚完整,毛细血管球结构无明显破坏,毛细血管腔狭窄减轻,系膜基质部分增生,HE染色结果见图1。

图1 各组大鼠肾小球HE染色

注：A:正常组;B:模型组;C:黄连低剂量组;D:黄连中剂量组;E:黄连高剂量组;F:厄贝沙坦组。

2.2 大鼠肾脏NF-κB免疫组化染色 正常组大鼠肾小球可见少量NF-κB表达,肾小管中几乎观察不到NF-κB着色;与正常组比较,模型组大鼠肾小球着色明显,经西药及黄连各剂量组干预后,NF-κB表达减少,结果见图2。平均积分光密度值显示,与正常组比较,模型组、厄贝沙坦组肾小球NF-κB表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,黄连各剂量组NF-κB表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),其中黄连中剂量组NF-κB表达最低,结果见表1。

图2 各组大鼠肾小球NF-κB免疫组化染色

注：A:正常组;B:模型组;C:黄连低剂量组;D:黄连中剂量组;E:黄连高剂量组;F:厄贝沙坦组。

表1 各组大鼠肾脏NF-κB免疫组化平均积分光密度值

注:与正常组比较*P<0.05;与模型组比较△P<0.05。

2.3 大鼠肾脏PPAR-γ mRNA表达 与正常组比较,模型组、黄连各剂量组、厄贝沙坦组PPAR-γ mRNA表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,黄连高剂量组及厄贝沙坦组PPAR-γ mRNA表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中厄贝沙坦组PPAR-γ mRNA表达高于黄连高剂量组(P<0.05),其余药物组间差异不明显(P>0.05),结果见图3。

图3 各组大鼠PPAR-γ mRNA PCR结果

注：与正常组比较*P<0.05;与模型组比较△P<0.05;与黄连高剂量组比较▲P<0.05。

3 讨论

DN的病理改变包括肾小球及肾小管间质肥大、肾小球基底膜增厚、细胞外基质蛋白在肾小球系膜及肾小管间质中的沉积[12]。本研究发现DN模型组肾小球体积缩小、纤维化,功能破坏明显,符合DN后期肾小球纤维化病理改变,经黄连及厄贝沙坦干预后,肾小球纤维化病变减轻,肾脏病理损伤缓解,说明黄连及厄贝沙坦具有缓解DN肾脏损伤的作用。

本研究免疫组化染色观察到模型组NF-κB表达集中于肾小球部分,而在肾小管中几乎观察不到NF-κB着色,提示在DN进展过程中,由NF-κB介导的炎性反应主要发生于肾小球内,其可能通过募集炎性反应细胞向肾小球聚集,诱发炎性反应,导致肾小球损伤。PCR检测发现,模型组肾脏皮质中对NF-κB具有抑制作用的PPAR-γ mRNA含量明显下降,提示在DN发病过程中,促进炎性反应蛋白的增多,和抑制炎性反应蛋白的减少,共同导致了DN肾小球损伤。通过药物干预,发现黄连及厄贝沙坦都能增加PPAR-γ mRNA的含量,提示二者可能通过PPAR-γ相关通路抑制了NF-κB及其介导的炎性反应,缓解了DN肾脏损伤。此外,黄连干预后,还可直接减少NF-κB在肾小球的表达,进一步抑制肾小球炎性反应,这可能由于黄连含有多种有效成分,与厄贝沙坦比较,能多靶点发挥抗炎作用,其具体机制有待深入研究。

总之,本研究发现黄连可减轻DN肾小球损伤,这可能与其抑制DN肾小球NF-κB蛋白表达、增强PPAR-γ mRNA表达相关。

[1]Pourghasem M,Shafi H,Babazadeh Z.Histological changes of kidney in diabetic nephropathy[J].Caspian J Intern Med,2015,6(3):120-127.

[2]孙雅琴,王晶,李社莉.糖尿病肾病的干细胞治疗研究进展[J].广西医学,2016,38(8):1135-1138.

[3]Chuang PY,Menon MC,He JC.Molecular targets for treatment of kidney fibrosis[J].J Mol Med(Berl),2013,91(5):549-559.

[4]臧会玲,王春炅,杨吉春,等.PPARγ在糖尿病肾病中的保护作用[J].生理科学进展,2010,41(6):435-438.

[5]Jia QQ,Wang JC,Long J,et al.Sesquiterpene lactones and their derivatives inhibit high glucose-induced NF-κB activation and MCP-1 and TGF-β1 expression in rat mesangial cells[J].Molecules,2013,18(10):13061-13077.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:285-286.

[7]仝小林,刘文科,徐国良,等.黄连治疗糖尿病的临床剂量及用药经验[J].中医杂志,2011,52(18):1604-1605.

[8]马航,胡慭然,邹宗尧,等.黄连生物碱降糖作用研究及构效关系初探[J].中国药理学通报,2015,31(11):1575-1579.

[9]Li LL,Chen ZQ,Wang YH,et al.Relationship between urinary nephrin and urinary albumin changes in diabetic rats and effects of yiqiyangyinhuayutongluo recipe[J].J Tradit Chin Med,2012,32(2):278-282.

[10]陈琦.中药药理研究方法学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2006:29-30.

[11]王蓉,王雯,张志坚,等.NK-кB mRNA及PPAR-γ mRNA在Barrett食管、食管腺癌的发病中的表达[J].临床消化病杂志,2009,21(4):195-197,205.

[12]Zheng Z,Zheng F.Immune Cells and Inflammation in Diabetic Nephropathy[J].J Diabetes Res,2016,2016:1841690.

(2016-11-28收稿 责任编辑：王明)

Effect of Coptis Chinensis on Expression of NF-κB and PPAR-γ in Kidney of Diabetic Nephropathy Rats

Guo Yangzhi1，Du Juan2，Li Xiangmin1，Feng Xingzhong1，Guo Wei3

(1BeijingShijitanHospital,Beijing100038,China; 2BeijingChangpingHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine,Beijing100038,China; 3TheMongolianMedicineandTCMHospitalofWuhai，Wuhai016000,China)

Objective:To investigate the effect of Coptis Chinensis on NF-κB, PPAR-γ and pathological changes of kidney in STZ-induced Diabetic Rats. Methods:Diabetic model in SD rats were established by intravenous injection of STZ combined with high-fat chow feeding. The models were randomly divided into a model group, an Irbesartan group [31.25 mg/(kg·d)], and Coptis Chinensis low-, mid-, and high-dose [equal with Coptis Chinensis used in human:83 mg/(kg·d),500 mg/(kg·d),1000 mg/(kg·d)] groups (n=8 each), other 8 SD rats were selected as normal group. After 12 consecutive weeks of administration, the expression of NF-κB and PPAR-γ in kidney was detected, and the pathological changes of kidney were observed. Results:The Coptis Chinensis groups decreased the expression of NF-κB (P<0.05); The Coptis Chinensis mid-dose group and Irbesartan group increased the expression of PPAR-γ(P<0.05); In all the Coptis Chinensis groups and Irbesartan group, pathological changes of kidney on STZ-induced diabetic rats were alleviated. Conclusion:Coptis Chinensis can decrease the expression of NF-κB, increase the expression of PPAR-γ and alleviate the pathological changes of kidney in STZ-induced Diabetic Rats.

Diabetic nephropathy；Coptis Chinensis；NF-κB；PPAR-γ

北京市中医药科技项目青年研究项目(编号:QN2014-08);北京世纪坛医院青年博士基金(编号:2016QB07);国家中医重点专科建设项目

郭杨志(1986.01—),男,博士,住院医师,研究方向:中医药防治糖尿病、肿瘤及老年病研究,E-mail:guoyangzhi@outlook.com

冯兴中(1964.10—),男,博士,主任医师,研究方向:中医药防治糖尿病及肿瘤研究,E-mail:fengxz9797@sina.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.044