平纤宁肺颗粒剂对肺纤维化大鼠肺组织中转化生长因子β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

张传名 茆俊卿 朱琴梅 陈 静

(1 江苏省扬州市中医院，扬州，225002； 2 扬州市职业大学，扬州，225009)

平纤宁肺颗粒剂对肺纤维化大鼠肺组织中转化生长因子β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

张传名1茆俊卿1朱琴梅2陈 静1

(1 江苏省扬州市中医院，扬州，225002； 2 扬州市职业大学，扬州，225009)

目的：观察平纤宁肺颗粒剂对盐酸博莱霉素所致大鼠肺纤维化的保护作用。方法：60只SD大鼠，雄性，按体质量随机分为正常对照组、模型组、平纤宁肺颗粒剂高剂量组、低剂量组，每组15只。盐酸博莱霉素气管内注射诱发肺纤维化，造模后给药，分别在给药7、14、28 d每组处死5只，取肺脏做组织病理学检测，同时免疫组化法检测肺组织内转化生长因子β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原。结果：模型组大鼠肺组织出现明显的炎细胞浸润，纤维结缔组织增生，平纤宁肺颗粒剂高、低剂量组大鼠在第14、28天的病理变化均较同期模型组减轻。模型组大鼠肺组织TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原表达在第7、14、28天均明显高于同期正常对照组，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01)。平纤宁肺颗粒剂高、低剂量组TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶表达与同期模型组比较明显降低，有统计学意义(P<0.05，0.01)。结论：平纤宁肺颗粒剂可以有效减轻肺纤维化，抑制肺组织中TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达。

平纤宁肺颗粒剂；肺纤维化；病理学；转化生长因子β1；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原

肺纤维化是一种渐进的慢性肺间质疾病，其主要病理特点是早期弥漫性的肺泡炎和后期大量成纤维细胞的病理性增生及基质胶原进行性沉积并取代正常的肺组织结构，大部分患者会在3～8年内死于呼吸衰竭[1-2]。尽管肺纤维化的患者死亡率很高，但是目前还没有治疗该病的有效方法，此病的发病机制及发展进程也不清楚。本研究使用盐酸博莱霉素(Bleomycin，BLM)制造大鼠肺纤维化模型[3]，观察平纤宁肺颗粒剂对盐酸博莱霉素所致大鼠肺纤维化的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠，60只，SPF级，由浙江省实验动物中心提供，许可证号为SCXK(浙)2014-0001。给药前后，SD大鼠分笼饲养，每笼5只，喂以全价颗粒鼠饲料(南京协同生物工程有限公司)，自由饮水饮食，室温20～25 ℃，每天人工光照12 h，室内通风良好，实验室相对湿度：65%～70%。

1.1.2 药物 平纤宁肺颗粒剂(由党参、干地黄、玄参、黄精、桑白皮、黄芩、金银花、虎杖、当归、丹参、红景天、川芎、甘草组成)，由江阴天江药业有限公司生产。

1.1.3 试剂与仪器 盐酸博莱霉素，日本化药株式会社，批号730342。Leica ASP300S全自动真空组织脱水机、Shandon包埋机、Shandon手动切片机、Shandon全自动染色机、OLYMPUS显微镜。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 60只SD大鼠随机分4组：正常对照组、模型组、平纤宁肺颗粒剂高剂量治疗组及平纤宁肺颗粒剂低剂量治疗组各15只。4组动物饲养1周后造模，除正常对照组外，其余各组均用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定于实验台上，颈部乙醇消毒后逐层暴露气管，博来霉素(5 mg/mL)一次性气管内注射(1 mL)，注射后立即将动物直立并旋转，使药液在肺内分布均匀；正常对照组在同样的条件下气管内注入相同体积的生理盐水。

1.2.2 给药方法 4组实验动物于造模后2 h开始灌药，中药平纤宁肺颗粒剂高、低剂量组比例为高剂量组：低剂量组=3∶1，低剂量组给予5 mL/kg，高剂量组给予15 mL/kg；正常对照组和模型组给予等量的生理盐水，1次/d。

1.2.3 检测指标与方法 每组动物于给药后第7、14、28天各处死5只，取右肺置于10%福尔马林液中固定；石蜡包埋；按6 μm厚连续切片4张，1张HE染色，3张分别为TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原免疫组化染色；备以光学显微镜观察。免疫组化试验步骤：1)石蜡切片常规脱蜡至水；2)PBS洗2遍，5 min/遍；3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭10分钟蒸馏水洗1次；4)抗原修复；5)PBS洗5 min；6)滴加正常山羊血清封闭液，室温10 min；7)甩去多余液体，滴加一抗4 ℃过夜(过夜后在37 ℃复温45 min)；8)PBS洗2次各5 min；9)滴加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min；10)PBS洗2次各5 min；11)滴加辣根过氧化物酶标记链霉菌抗生物素蛋白溶液，37 ℃孵育20 min；12)PBS洗2次各5 min；13)DAB显色5～10 min在显微镜下掌握染色程度；14)蒸馏水洗终止染色，苏木素复染；15)脱水，透明，封片，镜检。每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，用Image Pro Plus 5.0.2图像分析软件测定肺内TGF-β1、Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达。

2 结果

2.1 平纤宁肺颗粒剂对肺纤维化大鼠肺组织病理学的影响 每组动物于给药后第7、14、28天各处死5只，取右肺置于10%福尔马林液中固定；石蜡包埋；按6 μm厚连续切片，HE染色。病理组织学检测表明：正常对照组大鼠肺脏肺小叶结构正常，肺泡上皮细胞未见明显变性、坏死和脱落，肺泡壁无充血、水肿，肺泡腔及支气管腔内无渗出物，间质未见炎细胞浸润。模型组第7天肺泡间质可见轻度炎细胞浸润，纤维结缔组织增生；第14天,有较多炎性细胞浸润，伴有大量的纤维结缔组织增生；第28天，肺泡结构破坏，纤毛粘连倒伏、变性、坏死，间质可见中度炎细胞浸润，纤维结缔组织重度增生。平纤宁肺颗粒剂高、低剂量组大鼠肺也出现炎细胞浸润，纤维结缔组织增生病理表现，但在第14、28天的病理变化均较同期模型组减轻，其中以中药高剂量治疗组最为显著。见表1，图1。

2.2 平纤宁肺颗粒剂对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的影响 模型组与正常对照组比较，TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原平均光密度在第7、14、28天均明显高于同期正常对照组，说明其表达明显增强，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01)。平纤宁肺颗粒剂高、低剂量组TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原平均光密度与同期模型组比较明显降低，有统计学意义(P<0.05，0.01)，但仍比正常对照组高(P<0.05，0.01)，说明平纤宁肺颗粒剂可以有效抑制TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。见表2，图2、图3、图4。

表1 平纤宁肺颗粒剂对肺纤维化大鼠肺组织病理学的影响

表2 平纤宁肺颗粒剂对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的影响±s，n=5)

注：与正常对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05、△△P<0.01。

3 讨论

肺纤维化常常归属于中医“肺痿”“肺痹”范畴，有医家提出正气虚损、痰瘀互结的病理机制，我们总结临床病例的基础上提出肺肾不足，气阴耗伤，兼痰、热、瘀等病理产物为患的病机，确定补肺肾、清痰热、祛血瘀的治疗大法，故拟平纤宁肺颗粒剂治疗肺纤维化。通过实验观察，盐酸博莱霉素制造的大鼠肺纤维化模型早期以肺泡炎为主，后期以间质纤维化改变为主，平纤宁肺颗粒剂高、低剂量组大鼠肺也出现炎细胞浸润、纤维结缔组织增生的病理表现，但在第14、28天的病理变化均较同期模型组减轻，其中高剂量组最为显著，说明平纤宁肺颗粒剂能改善大鼠肺纤维化的病理变化。众多研究表明[4-13]转化生长因子β1是细胞外基质沉积最强的促进剂，还能抑制胶原的降解，在肺纤维化发病机制中的作用显著，说明抑制转化生长因子β1的产生或阻断其表达途径可抑制肺纤维化的疾病进展。实验中平纤宁肺颗粒剂高、低剂量组转化生长因子β1的平均光密度与同期模型组比较明显降低，表明平纤宁肺颗粒剂有抑制转化生长因子β1表达的作用。大鼠和人在发生肺纤维化时，胶原代谢出现紊乱，以Ⅰ、Ⅲ型胶原含量增加为主，Ⅰ型和Ⅲ型胶原比例失调，导致胶原在肺间质中沉积，使肺组织基质结构紊乱而发生肺纤维化[13-14]。显然发生肺纤维化时，降低Ⅰ、Ⅲ型胶原含量可以改善肺纤维化。有人发现[15]气虚血瘀证患者Ⅲ型胶原含量明显增高，而益气活血可显著降低其含量，平纤宁肺颗粒剂组方能补益肺气，活血化瘀，实验亦显示平纤宁肺颗粒剂能明显抑制肺纤维化大鼠模型Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达，具有抗肺纤维化的作用，为临床治疗肺纤维化提供了有利依据。

图1 给药7 d、14 d、28 d之后HE染色结果

续图1 给药7 d、14 d、28 d之后HE染色结果

图2 给药7 d、14 d、28 d之后大鼠肺组织TGF-β1免疫组化染色结果

图3 给药7 d、14 d、28 d之后大鼠肺组织Ⅰ型胶原免疫组化染色结果

图4 给药7 d、14 d、28 d之后大鼠肺组织Ⅲ型胶原免疫组化染色结果

续图4 给药7 d、14 d、28 d之后大鼠肺组织Ⅲ型胶原免疫组化染色结果

本实验结果表明平纤宁肺颗粒剂有减轻肺泡炎和抗肺纤维化的作用，且有剂量依赖关系，提示应用

中医复方平纤宁肺颗粒剂治疗肺纤维化具有可行性，但仍需从药物剂量、药物安全性及其作用机制等方面进行进一步的探讨。

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(2016-04-18收稿 责任编辑：徐颖)

Effect of Pingxianningfei Granule on the Expression of TGF-β1, TypeⅠand Type Ⅲ Collagen in Rats with Pulmonary Fibrosis

Zhang Chuanming1, Mao Junqing1, Zhu Qinmei2, Chen Jing1

(1YangzhouHospitalofChineseMedicine,Yangzhou225002,China; 2YangzhouPolytechnicCollege,Yangzhou225009,China)

Objective:To observe the protection effect of Pingxianningfei Granule in rats with Bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Methods:Sixty male SD rats were randomly divided into a control group, a model group(MG), a high-dose Pingxianningfei Granule group(HG) and a low-dose Pingxianningfei Granule group(LG), 15 in each. Model rats with Pulmonary Fibrosis were induced by injecting bleomycin into trachea. Respectively, 7, 14, 28 days after successfully medication, the rats were sacrificed, 5 in each group. Taking the lung, and analysis in histopathology. And the expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1), typeⅠand type Ⅲ Collagen in lung tissue was assayed by immunohistochemistry. Results:Infiltration of inflammatory cells were obvious in lung tissue of MG and the fibrous connective tissue proliferated. The pathologic changes of lung in HG and LG at 14, 28 days were milder than those in MG. The expression of TGF-β1, typeⅠand type Ⅲ Collagen in MG at 7, 14, 28 days was much higher than that of the control group, with statistical significance (P<0.01). Compared with the MG, the expression of TGF-β1, typeⅠand type Ⅲ Collagen of the lung in HG and LG was decreased, which showed significant difference (P<0.05, 0.01).Conclusion:Pingxianningfei Granule can effectively reduce the formation of pulmonary fibrosis and inhibit the expression of TGF-β1, typeⅠand type Ⅲ Collagen in lung tissue.

Pingxianningfei Granule; Pulmonary fibrosis; Pathology; TGF-β1; Collagen typeⅠ; Collagen type Ⅲ

江苏省中医药局科技项目(编号：LZ13190)

张传名(1977.02—)，男，硕士，副主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中医肺病学，E-mail：821767383@qq.com

茆俊卿(1959.05—)，女，硕士，教授，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中医肺病学，E-mail：zgyz1955@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.041