海南省不明原因发热病人中钩端螺旋体病的实验检测结果分析

吴 捷,王 丹,王少玲, 陈 莉,叶浩然,杜中华, 华 德,李丹丹,蒋秀高

海南省不明原因发热病人中钩端螺旋体病的实验检测结果分析

吴 捷1,王 丹1,王少玲1, 陈 莉1,叶浩然1,杜中华1, 华 德1,李丹丹1,蒋秀高2

目的 了解海南省不明原因发热病人中钩端螺旋体病的感染情况。方法 分别用钩端螺旋体显微镜凝集试验(MAT)、酶联免疫试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)法，检测海南省2015年全省不明原因发热病人的血标本。结果 共检测标本179份，其中显微镜凝集试验检出阳性标本40份，感染率为22.35%，男性感染率为21.65%(21/97),女性感染率为23.17%(19/82)；菌群中有7个群能检出，分别是问号钩端螺旋体黄疸出血群、拜伦群、秋季热群、波摩那群、流感伤寒群、赛罗群、塔拉索夫群；酶联免疫试验检测阳性38份，阳性率为21.23%，其中IgM阳性6份，检出率为3.35%，IgG阳性32份，检测率为17.88%；血清学检测结果一致。PCR法检测结果均为阴性。结论 海南省不明原因发热病人中存在钩端螺旋体的感染，主要型别以黄疸出血群为主。

钩端螺旋体病；血清学；聚合酶链反应；海南省

钩端螺旋体病(Leptospirosis)简称钩体病，是由各种致病性钩端螺旋体引起的一种急性全身性感染的自然疫源性疾病[1]。该病的临床症状表现为高热、结膜充血、腓肠肌压痛、全身酸痛，溶血性贫血，肺出血，严重时可出现全身出血倾向、肝、肾、中枢神经系统损害。病例流行常与洪涝灾害有关[2]。近年来，虽然海南省钩体病的发病率有所下降，但是海南省是自然灾害频繁且较为严重的地区，传播流行常与洪涝灾害有关的钩体病也应该要引起我们的关注。本研究对2015年全省不明原因发热病人进行了钩端螺旋体病的调查研究。

1 材料与方法

1.1 标本来源 采取2015年海南省不明原因持续发热≥38.5 ℃病人血清标本179份，其中女性82份(45.81%)，男性97份(54.19%)，年龄范围为3岁—98岁，平均年龄为 51 岁。

1.2 试剂 人血清钩端螺旋体IgM/IgG抗体检测试剂盒购自德国赛润公司，批号为：20160829；病人血液标本DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，所需引物由上海生工合成，Taq酶和DL2000 Markers分子量对照由TaKaRa公司提供。

1.3 血清抗体检测方法

1.3.1 钩体显微镜凝集试验(MAT)按照《钩端螺旋体诊断标准-中华人民共和国卫生行业标准》WS290-2008 进行试验操作和结果判定。血清抗体滴度≥1∶400为阳性。

1.3.2 酶联免疫试验(ELISA)原理 运用抗原与抗体的特异性反应特点，将所需的特异性病原体抗原包被在检测微孔板的检测条上，如果病人血清标本中含有抗体，抗体就可与包被的抗原结合形成了免疫复合物。具有碱性磷酸酶标记的二抗继而与免疫复合物结合，无色的底物对硝基苯磷酸盐被转变为有色产物对硝基苯酚。样本中抗体的浓度与反应物的颜色深浅成正比，并可用吸光度测量来表示。按试剂说明书进行试验操作，在405 nm下，读取OD值。

1.3.3 PCR法 按照《WS290-2800》中提供的序列合成所需引物1∶5，-CTGAATCGCTGTATAAAAGT-3，引物2：5，-GGAAAACAAATGGTCGGAAG-3，反应总体系为25 μL，包含：Pre Mix Taq 12.5 μL，上引物和下引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板5 μL，无菌去离子水2.5 μL。反应步骤为：首先94 ℃预变性 5 min，接着94 ℃变性60 s，然后55 ℃退火60 s，再是72 ℃延伸90 s，共计35个循环，最后72 ℃总延伸10 min，扩增产物分子大小为：285 bp。

1.4 统计分析：用Excel表格统计和处理数据资料，实验结果的比较用χ2检验，统计分析采用SPSS 20.0 进行结果分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 疫情报告情况 据“中国疾病预防控制信息系统”资料显示：海南省2010年钩体发病率0.03/10万,2011年为0.05/10万,2012年为0.05/10万,2013年为0.03/10万,2014年为0.07/10万，2015年为0.02/10万；病例主要分布情况为：2010年文昌3例，2011年文昌1例，东方1例，屯昌1例，乐东1例，2012年三亚1例，文昌2例，乐东1例，2013年海口1例，儋州1例，陵水1例；2014年海口1例，儋州2例，文昌2例，澄迈1例；2015年儋州2例。

2.2 2015年由医院送检的不明原因发热病人概况 市县分布有海口20例，澄迈6例，儋州3例，屯昌9例，白沙13例，保亭8例，乐东12例，东方10例，琼中9例，临高25例，定安14例，万宁7例，文昌8例，琼海7例，昌江6例，陵水8例， 三亚5例，五指山5例，洋浦4例，总共179例，其中女性82例，男性97例，平均年龄为 51岁，职业以农民为主。钩体病既往感染或现症感染40例，市县分布为：海口市2例，屯昌县6例，琼海市1例，临高县7例，乐东县4例，琼中县3例，五指山市1例，陵水县1例，保亭县5例，万宁市2例，文昌市1例，定安县1例，东方市2例，昌江县1例和白沙县3例，分布范围广泛。近期多有田间劳作可疑疫水接触史，家中老鼠活动频繁，同时出现发热、头晕、头痛、畏寒、腓肠肌痛、结膜充血、皮肤巩膜黄染、淋巴结肿大、全身肌肉酸痛、乏力、食欲减退、呕吐等单一症状或多种症状，外周血WBC多数伴有升高，经青霉素治疗好转。

2.2.1 性别分布 被检测的不明原因发热病人有179例，显微镜凝集试验检出阳性标本40份，感染率为22.35%，男性21人阳性，感染率为21.65%(21/97),女性19人阳性,感染率为23.17%(19/82)；酶联免疫试验检测阳性38份，阳性率为21.23%，男性21人阳性，感染率为21.65%(21/97), 女性17人阳性,感染率为20.73%(17/82)。两种方法检测男女之间钩端螺旋体血清抗体阳性率差异均无统计学意义。

2.2.2 年龄分布 共观察的不明原因发热病例数有179份，显微镜凝集试验法(MAT)和ELISA法检验的P值均大于0.05，表示各年龄间均无统计学意义(见表1)。

2.2.3 季节分布 病人发病月份主要集中在6-11月份，这主要与海南省的多雨季节以及水稻收割工作有关。

表1 MAT和ELISA方法中的年龄分布的比较

Table.1 Comparison of age distribution in MAT and ELISA methods

方法MethodMATELISA阳性Positive阴性Negative阳性Positive阴性Negative20岁以下Under20years41223021-3032244631-4042685241-50102045651-60736105961岁以上Above61yeas12231059χ28.8863.633P0.1140.603

2.3 实验结果

2.3.1 钩端螺旋体MAT菌群与滴度分布 表1中，各个年龄段均有钩端螺旋体感染，钩端螺旋体总感染率为22.35%(40/179)，男性感染率为21.65%(21/97),女性感染率为23.17%(19/82)；钩端螺旋体显微镜凝集试验以≥1∶400为阳性，总阳性率为5.03%(9/179)，1≥100为弱阳性率，弱阳性率则为17.32%(31/179)；菌群中有7个群能检出，分别是黄疸出血群(56601)、拜伦群(56604)、秋季热群(56606)、波摩那群(56608)、流感伤寒群(56609)、赛罗群(56635)、塔拉索夫(56613)；黄疸出血群(56601)检出的例数最多占26例，其次是赛罗群(56635)有5例检出；MAT滴度达1∶800有2例，其中1例是黄疸出血群(56601)、1例是赛罗群(56635)；滴度达1∶400有6例，黄疸出血群(56601)和赛罗群(56635)分别有4例和2例；MAT滴度1∶100最多是黄疸出血群(56601)有13例，MAT滴度1∶200最多也是黄疸出血群(56601)有8例；其他见表2中所示。

2.3.2 酶联免疫试验检测阳性38份，阳性率为21.23%，其中IgM阳性6份，检出率为3.35%，IgG阳性32份，检测率为17.89%；血清学检测结果一致。PCR法检测结果均为阴性。

3 讨 论

钩体病是一种人兽共患的自然疫源性疾病，它的暴发流行受自然因素(气温、地形、降水量等)，生物因素(如鼠密度、鼠带菌率等)以及社会因素(居住环境、生活条件等)的影响[3-4]。钩体病的宿主动物多，感染动物的肾脏可成为主要的储存菌器官，鼠类和猪作为该病的主要带菌宿主，可长期通过尿液排菌，形成传染源[5-10]。海南岛位于热带北缘，属于热带季风气候，气候潮湿温暖，有明显的多雨季和少雨季，每年的11月至翌年4月为少雨季，5-10月为多雨季，雨源主要有热雷雨、锋面雨和台风雨，年平均降雨量1 639 mm。河流密布，植物繁多，森林覆盖率高达40%，植被生长快，是热带季雨林和热带雨林的原生地，非常适合多种野生动物栖息和繁衍，尤其的海南岛一年四季农作物丰富，也为老鼠的大量繁殖提供了生存条件。潘会明等报道鼠密度与钩体病的发病率密切相关[11-12],表明鼠类是传播钩体病的重要传染源之一，提示我们今后要以灭鼠为工作重点来进行钩体病的防治。

表2 海南省钩端螺旋体MAT菌群及滴度分布

Table.2 Distribution of leptosperosis MAT group and titers in Hainan Province

菌群号GroupNo.MAT滴度MATTiter1∶1001∶2001∶4001∶800合计566011384126566041100256606020025660802013566091000156613100015663511215合计17146340

上个世纪70年代钩体病曾在海南有过较大流行，90年代潘祖安等人对海南省9个市县中10个乡镇529份健康人群的血清进行抗体检测[13]，提示各地感染率为25.9%～72.2%不等；笔者也曾对1999—2002年海口地区各医院送检的96份疑是钩体病患者进行抗体检测，感染率为36.5%[14]，这些资料证实海南省健康人群中存在钩体病的感染，散发病例常年发生。90年代钩体感染与性别无关，与职业和年龄密切相关，而且感染的血清群以巴达维亚群、黄疸出血群和流感伤寒群为主。从本次调查结果看，钩体感染与性别无关，这点再次得到证实，各个年龄段均可感染，感染的血清群主要以黄疸出血群为优势群，这与90年代潘祖安等人的调查有所不同，钩端螺旋体菌群出现的变化，这点值得引起我们的关注，警示我们要留意钩端螺旋体菌群更迭而引起钩体病的暴发流行[15-16]。

(本调查得到中国疾控中心传控所钩体室以及广西省疾控中心的大力支持，特此感谢！)

[1] Huang LL,Guo XK.The progress in the research of leptospires. [J].Int J Biologicals,2010,33(2):66-70.(in Chinese)

黄莉莉，郭晓奎.钩端螺旋体研究进展[J].国际生物制品学杂志，2010，33(2)：66-70.

[2] Zhou J,Huang X,He HX, et al.Epidemiological study on leptospirosa infection of host animals and healthy population in flood areas[J].J Cent South Univ(Med Sci),2009,34(2):99-103.(in Chinese)

周价，黄昕，何华先，等.洪灾区钩端螺旋体宿主动物及健康人群感染情况的流行病学研究. [J].中南大学学报(医学版)，2009,34(2)99-103.

[3] Liu B,Ding F,Jiang XG,et al.Epidemiology of leptospirosis in China[J].2006-2010.Disease Surveillance,2012,27(1):46-50.(in Chinese)

刘波，丁凡，蒋秀高，等.2006-2010年中国钩端螺旋体病流行病学分析[J].疾病监测，2012，27(1)：46-50.

[4] Liu Y,Chen ZH,Li SJ,et al.Epidemic characteristics of leptospirosis in Guizhou Province from 2010 to 2014[J]. Chin J Zoonoses,2016,32(11):1034-1.38.(in Chinese)

刘英, 陈峥宏, 李世军, 等. 贵州省2010-2014年钩端螺旋体病流行特征分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2016, 32(11): 1034-1038.

[5] Sun XK,Deng YL,Huang JY,et al.Serum epidemiological analysis of leptospirosis in Qingyuan city,Guangdong Province[J].Chin J Zoonoses,2011,27(2):161-164.(in Chinese)

孙小康，邓远玲，黄金英，等.广东省清远市钩端螺旋体病血清流行病学分析[J].中国人兽共患病学报，2011，27(2)：161-164.

[6] Li SJ，Zhang CC，Li XW，et al. Molecular typing ofLeptospirainterrogansstrains isolated fromRattustanezumiin Guizhou Province,Southwest of China[J]. Biomed Environ Sci, 2012, 25(5): 542-548.DOI: 10.3967/0895-3988.2012.05.007

[7] Liu Y,Chen H,Li PL,et al.Sergroup identification and analysis of Leptospira isolates using serogroup specific PCR in Guizhou Province,China[J].Chin J Zoonoses,2015,31(12):1146-1150,1156.(in Chinese)

刘英，陈红，李沛李，等.贵州省钩端螺旋体血清群特异性PCR鉴定结果与分析[J].中国人兽共患病学报，2015，31(12)：1146-1150,1156.

[8] Zhang CL,Wang H,Yan J.Leptospirosis prevalence in Chinese populations in the last two decades[J]. Microbes Infect, 2012, 14(2):317-323. DOI: 10.1016/j.micinf.2011.11.007.

[9] Huang DH,Zeng J,Jiang ZL,et al. Consistency evaluation of two detection methods for Leptospirosis [J].Pract Prev Med, 2015，22(10)：1262-1263,1270.(in Chinese)

黄德蕙，曽竣，蒋震羚，等.两种方法检测钩端螺旋体病的一致性评价[J].实用预防医学，2015，22(10)：1262-1263,1270.

[10] Mayer-Scholl A, Draeger A, Luge E, et al. Comparison of two PCR systems for the rapid detection ofLeptospiraspp. from kidney tissue[J]. Curr Microbiol, 2011, 62(4): 1104-1106. DOI: 10.1007/s00284-010-9829-5.

[11] Pan HM,Cheng DM,Ruan SY,et al.Influence of the rodent density to the leptospirosis epidemic[J].Chin J Vector Bio Control, 2003，14(1)：47-49.(in Chinese)

潘会明，程德明，阮绍玉，等.鼠类种群数量变动对钩端螺旋体病流行的影响[J].中国媒介生物学及控制杂志，2003，14(1)：47-49.

[12] Zhao MH,Xu TL,Zhang Q,et al.Detection and sequencing analysis ofLeptospiracarried by rats from Jiangxi Port and Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau’s supervision areas[J]. Chin J Zoonoses, 2016, 32(7): 674-678.(in Chinese)

赵明惠, 徐铁龙, 张强,等. 江西口岸及国检监管区鼠类感染钩端螺旋体的检测及基因序列分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2016, 32(7): 674-678.

[13] Pan ZA,He QY.The Sero-epidemiological investigation of Leptospirosis in Hainan Province[J].Chin J Epidemiol, 1995，16(6)：369-371.(in Chinese)

潘祖安，何启亚.海南省钩端螺旋体病血清学流行病学调查 [J].中华流行病学杂志，1995，16(6)：369-371.

[14] Wu J,Wang JH.Comparison of heat-resistant Patoc I antigenic slide agglutination and dot ELISA for detection of antibody against leptospira[J].Chin Tropical Med, 2005，5(1)：115,66.(in Chinese)

吴捷，王家豪.耐热Patoc I抗原玻片凝集和斑点酶ELISA检测钩体抗体比较 [J].中国热带医学，2005，5(1)：115，66.

[15] Zeng LZ,Zeng YX,Liu XC,et al.Accuracy investigation of the reported leptospirosis cases in high prevalence counties in Sichuan Province,China[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(12): 1200-1203.(in Chinese)

曾林子，曾义学，刘学成，等. 四川省钩端螺旋体病高发县报告病例的准确性调查研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2015, 31(12): 1200-1203.

[16] Wang ZD,Wang SS,Liu LJ,et al.The infection status of Leptospira in rodents on the Heixiazi island of Heilongjiang province,China,in 2011[J]. Chin J Prev Med,2013，47(6)：510-513.(in Chinese)

王振东，王莎莎，刘丽娟，等.2011年黑龙江省黑瞎子岛群中钩端螺旋体感染状况调查. [J].中华预防医学杂志，2013，47(6)：510-513.

Leptospirosis detection among patients with fever in Hainan Province, China

WU Jie1, WANG Dan1, WANG Shao-ling1, CHEN Li1, YE Hao-ran1,
DU Zhong-hua1, HUA De1, LI Dan-dan1, JIANG Xiu-gao2

(1.HainanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Haikou570203,China; 2.ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

We investigated the situation of leptosperosis infection among patients with fever in Hainan Province in China. Blood samples of patient from Hainan Province in the year of 2015 were detected forLeptospiraby microscope agglutination test (MAT), enzyme-linked immunity test (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR), respectively. Results showed that 179 blood samples of patients with fever were found, and microscope agglutination test detected 40 positive samples, with a infection rate of 22.35%. The infection rate was 21.65%(21/97) for male and 23.17%(19/82) for female. Seven groups of bacteria were found includingLeptospiraserogroup icterohemorrhagie, ballom group, autumralis group, pomona group, grippotyphosa group, Sejroe group and Batavia group. Thirty-eight samples were tested positive by ELISA, with a positive rate of 21.23%, in which six samples were IgM positive (detection rate =3.35%) and 32 samples were IgG positive (detection rate=17.88%). Serological detected with MAT and ELISA methods results were consistent and that were tested negative by PCR. Results of our study supported the presence ofLeptospirainfection infection among the patients with fever of unknown origin (FUO) in Hainan Province. The main types areLeptospiraserogroup icterohemorrhagie.

leptospirosis; serology; polymerase chain reaction; Hainan Province Supported by the Nature Science Foundation of Hainan Province (No. 20168332) Corresponding author: Jiang Xiu-gao, Email: jiangxiugao@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.016

海南省自然科学基金项目(No.20168332)

蒋秀高，Email: jiangxiugao@icdc.cn

1.海南省疾病预防控制中心，海口 570203； 2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 102206

R377

A

1002-2694(2017)03-0276-04

2016-10-11 编辑：王晓欢