苎麻根际土壤水浸提液对拟南芥幼苗生长的化感效应

刘楠楠，杨瑞芳，李林林，白玉超，李雪玲，崔国贤，2*

（1.湖南农业大学苎麻研究所，长沙410128；2.湖南农业大学，长沙410128）

苎麻根际土壤水浸提液对拟南芥幼苗生长的化感效应

刘楠楠1，杨瑞芳1，李林林1，白玉超1，李雪玲1，崔国贤1，2*

（1.湖南农业大学苎麻研究所，长沙410128；2.湖南农业大学，长沙410128）

通过种子萌发实验研究了不同浓度（0、1、2、10 mL／皿）不同苎麻品种根际土壤水浸液对模式植物拟南芥幼苗生长的化感效应，并运用相对实时定量PCR（QPCR）技术从基因水平探讨了不同浓度根际土壤水浸提液处理后与拟南芥生长素合成相关基因YUC1（AT4G32540）的表达。结果表明，随着苎麻根际土壤水浸液浓度的升高，拟南芥幼苗在中苎1号根际土壤处理下其根长与对照相比均呈现出抑制效应，在湘苎7号根际土壤处理下其根长与对照相比呈现出低促高抑现象。在中苎1号根际土壤处理下拟南芥幼苗丙二醛（MDA）含量随着苎麻根际土壤水浸提液浓度升高而上升，在湘苎7号根际土壤处理下拟南芥幼苗丙二醛（MDA）含量在低浓度时，与对照相比降低，当浓度升高，其含量呈现出升高趋势。在不同浓度根际土壤水浸提液处理下，拟南芥幼苗的过氧化物歧化酶（SOD）活性均表现为随处理浓度升高，SOD活性下降，且在中苎1号处理下，下降幅度较湘苎7号大。QPCR检测结果表明，2个苎麻品种处理下YUC1其基因的表达量随水浸提液浓度增加均降低，且中苎1号下降幅度较湘苎7号大。可见，随浸提液浓度升高，苎麻对拟南芥生长的化感胁迫性增强。

苎麻；根际土壤水浸提液；拟南芥；化感效应；抗氧化酶；YUC1基因表达量

化感作用（Allelopathy）是指一种植物通过向环境释放化学物质而对另一种植物（包括微生物）所产生的直接或间接的伤害作用［1］。研究发现植物释放的化学物质不仅仅是对其他植物有害，对自身也有毒害作用，特别是在作物、人工再生林方面表现明显，所以自毒作用也是化感作用的一个部分［2］。植物化感物质主要通过雨雾淋溶、自然挥发、根分泌和植株分解等4种途径释放到环境中，但种子萌发和花粉在风或昆虫作用下的传播途径也是化感物质释放到环境中的有效途径。无论何种途径，释放到环境中的化感物质只可能是水溶和油溶两种性质。本实验主要探讨了苎麻根际土壤水溶性化感物质对模式植物拟南芥幼苗的影响。

苎麻（Boehmeria niveaL.）是荨麻科（Urticaceae）苎麻属（Boehmeria）多年生宿根性旱地草本植物，是我国特色经济作物和纤维作物。一般情况下，苎麻可以宿根种植10～20年，然而在正常的栽培管理措施下出现了苎麻连续种植3～5年后，发生烂蔸或者缺蔸的现象，导致苎麻的产量和品质均下降，严重的甚至引起全株死亡［3－4］。苎麻在长期多年的生长发育中经常会受到连作栽培的影响，研究表明连作栽培极易产生化感自毒作用，而化感现象的产生可能是由于土壤内部化感物质常年累加引起。朱四元等［5－6］研究也认为，苎麻宿根生长障碍主要是由连作多年土壤中毒引起的。本实验以湖南地区主要栽培的2个苎麻品种（中苎1号和湘苎7号）为供体，拟南芥为受体，探讨了苎麻根际土壤水浸提液对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响，并运用相对实时定量PCR技术检测了经土壤浸提液处理后与生长素合成相关基因YUC1（AT4G32540）的表达，初步揭示了苎麻的化感作用，为缓解苎麻败蔸提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试苎麻品种为中苎1号、湘苎7号；供试受体为拟南芥（哥伦比亚生态型）。

1.2 试验设计

1.2.1 浸提液制备

取根际土壤样（未烘干）6.5 kg按1∶2比例加入蒸馏水浸泡，不定期搅拌，浸泡48 h后用4层纱布进行粗过滤收集得到粗浸提液，将粗滤液置于离心机（转速：1000 r；时间：2 min）离心得到澄清的滤液，再将滤液先过定性滤纸再过孔径0.45μm的微孔滤膜得到精滤液8500 mL，并浓缩至500 mL，得到浓度为8.5 g／mL（即1 mL水溶液中含有8.5 g土壤的浸提物）的液体作为母液，放置于4℃的冰箱待用。

1.2.2 种子萌发实验

选取大小一致，颗粒饱满的拟南芥种子，用15%的bleach消毒液消毒3 min，再用无菌蒸馏水冲洗5次，待用。配制1／2 MS培养基，分别在培养基中加入0（CK）、1、2、10 mL母液，调节pH＝5.8后于灭菌锅121℃湿热灭菌20 min后待用。在无菌操作台中，进行点种，每皿拟南芥种子40粒，每个处理重复3次，密封。放置于温度25℃、湿度75%RH、光照2000 Lx的光照培养箱中进行培养。每天记录种子发芽数直到种子不再萌发时分别测量幼苗下胚轴的长度。

1.2.3 丙二醛（MDA）含量的测定

使用硫代巴比妥酸酸（TBA）显色法进行MDA含量的测定，具体方法参照参考文献［7－8］。

1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）含量的测定

氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力，具体方法参照参考文献［9］。

1.2.5 YUC1相对含量的测定

1.2.5.1 RNA的提取

选取生长在加入不同浓度苎麻土壤浸提液的1／2 MS培养基培养10 d的拟南芥幼苗，将其整株置于离心管后迅速投入液氮中冷冻，参照sigma公司植物RNA提取试剂盒的说明书对拟南芥进行RNA的提取；RNA逆转录参照TaKaRa生物公司的逆转录试剂盒进行。转录完的cDNA依据PCR检查的亮度稀释15～20倍。

1.2.5.2YUC1基因相对表达量检测

本实验采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪，PCR反应设置的条件为：95℃5 min，95℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，循环总数40个。实验所涉及的定量引物序列见表1，实验的均一化内参以ACTIN－2基因表达的丰度为依据。10μL体系：5μL SYBR Green Mix，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，0.2μL Rox，3.8μL稀释后的cDNA模板。

表1 实时荧光定量PCR检测引物序列Tab.1 Primer sequences used for Quantitative Real－time PCR（QPCR）

1.3 数据处理

采用DPS数据处理系统（v7.05专业版）进行方差显著性分析，Microsoft Excel 2007进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 种子萌发及根长结果分析

由图1及图2可知，在不同浓度中苎1号和湘苎7号根际土壤水浸提液处理下，拟南芥幼苗在处理后第一天萌发数差异较大，种子萌发数呈现出CK＞1 mL＞2 mL＞10 mL趋势，在处理的后几天时间里，10 mL／皿处理的萌发数总体均小于CK及1 mL和2 mL处理。由图3可知，在不同浓度中苎1号根际土壤水浸提液处理下，2 mL及10 mL浓度处理下根长与CK相比显著抑制，1 mL浓度处理下根长与CK差异不显著；在不同浓度湘苎7号根际土壤水浸提液处理下，在1 mL及2 mL浓度处理下根长与CK相比差异不显著，10 mL浓度处理下根长显著被抑制。在同一浓度处理下，中苎1号根际土壤处理的拟南芥幼苗根长均小于湘苎7号根际土壤处理的幼苗根长。

2.2 MDA含量及SOD含量检测分析

由图4可知，中苎1号根际土壤水浸提液处理下，拟南芥幼苗的MDA含量随处理浓度的提高呈上升趋势，10 mL浓度处理下MDA含量最高；湘苎7号根际土壤水浸提液处理下，拟南芥幼苗的在1 mL浓度处理下MDA含量较CK低，随着处理浓度的加大，拟南芥幼苗的MDA含量呈上升趋势，在10 mL浓度处理下含量最高。在同一浓度处理下，湘苎7号根际土壤处理的拟南芥幼苗MDA含量均低于中苎1号根际土壤处理的幼苗。

由图5可知，随着处理的土壤浸提液浓度的增加，2个品种和处理下，SOD含量均呈下降趋势，且在同一浓度不同品种处理下，中苎1号处理下幼苗SOD含量较湘苎7号处理下低。

2.3 YUC1相对含量检测结果分析

由图6可知，随着处理的土壤浸提液浓度的增加，两个品种处理下，YUC1基因的相对表达量均呈下降趋势，且与对照差异显著，且在不同品种同一浓度处理下，中苎1号土壤处理下YUC1基因相对表达量较湘苎7号少。

图1 不同浓度中苎1号根际土壤水浸提液处理下拟南芥种子萌发数Fig.1 Different concentrations of Zhongzhu－1 rhizosphere soilwater extract number of arabidopsis seed germination under processing

图2 不同浓度湘苎7号根际土壤水浸提液处理下拟南芥种子萌发数Fig.2 Different concentrations of Xiangzhu－7 rhizosphere soil water extract number of arabidopsis seed germination under processing

图3 不同品种不同浓度苎麻根际土壤水浸提液对拟南芥根长的影响Fig.3 Different varieties of different concentration of ramie rhizosphere soilwater extract on arabidopsis root long effec

图4 不同品种不同浓度苎麻根际土壤水浸 提液处理对拟南芥MDA含量的影响Fig.4 Different varieties of different concentration of ramie rhizosphere soilwater leaching solution treatment effect on MDA content in arabidopsis thaliana

图5 不同品种不同浓度苎麻根际土壤水浸提液处理对拟南芥SOD含量的影响Fig.5 Different varieties of different concentration of ramie rhizosphere soil water leaching solution treatment effect on SOD content in arabidopsis thaliana

图6 不同品种不同浓度苎麻根际土壤水浸提液 处理对拟南芥YUC1相对表达量的影响Fig.6 Different varieties of different concentration of ramie rhizosphere soil water leaching solution treatment on the influence of the relative expression of arabidopsis YU C1

3 讨论

苎麻败蔸对麻纤维的产量和质量均有较大的影响［10］。前期对苎麻败蔸原因的分析主要集中在病虫害严重、栽培管理粗放、除草剂和化肥施用不当等方面，然而，苎麻败蔸除了受外界因素影响外，不同基因型品种的败蔸情况差别也很大，白玉超［11］等人的前期研究表明，频繁刈割下苎麻的败蔸率为中苎1号最高，湘苎7号败蔸率最低，本实验主要从化感效应方面探讨了败蔸率差异较大的2个苎麻品种。

两个苎麻品种根际土壤水浸提液对拟南芥幼苗的根长均有影响，总体呈现出低促高抑的趋势，且高浓度根际土壤水浸提液处理下会使拟南芥幼苗体内的超氧化物歧化酶SOD的活性降低，前期研究表明，化感物质会导致受体植物体内SOD活性降低，从而使受体植物体内活性氧增多，启动膜脂过氧化，从而破坏膜的结构，增加膜透性，K＋溢出，最终导致受体植物生长受阻［12］。同时，高浓度根际土壤水浸提液处理下拟南芥幼苗体内的丙二醛MDA含量增加，MDA是膜脂过氧化最终分解的产物，实验结果进一步表明根际土壤水浸提液中所含物质对拟南芥幼苗的细胞膜膜和细胞造成了伤害。

两个苎麻品种根际土壤水浸提液对拟南芥幼苗的生长素合成相关基因YUC1均有影响，总体呈现出随处理液浓度的加大，YUC1该基因的相对表达量减少，且下降幅度表现为：中苎1号处理大于湘苎7号处理［1］。

苎麻根际土壤水浸提液中的化学物质对其他植物生长的抑制作用表明了苎麻自身释放了化感物质，其可能为导致苎麻败蔸的内因之一，由本实验结果及大田观测苎麻地几乎无杂草两方面初步推测苎麻自身释放了一些化学物质，这些物质随着种植年限的积累对其自身及周围植物均有害，所以出现连作多年的麻败蔸率提高，本实验为延缓苎麻败蔸提供了新的探究方向。

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The Allelopathy of Ram ie Rhizosphere SoilWater Extract on Arabidopsis Thaliana Seed ling Grow th

LIU Nannan1，YANG Ruifang1，BAIYuchao1，LIXueling1，CUIGuoxian1，2
（1.Ramie Research Institute of Hunan Agricultural University，Changsha 410128 China；2.Hunan Agricultural University，Changsha 410208 China）

The seed germination experiment is used to study the different concentrations（0，1 and 2，10 mL／dish）and the different ramie varieties rhizosphere soil water extract allelopathic effect on the model plantArabidopsis thalianaseedlings，and relative real－time quantitative PCR（QPCR）technology was applied to probe into the YUC1（AT4G32540）gene expression related to auxin biosynthesis after treatment.Results showed that different concentration ofwater extracts from rhizosphere soil of ramie had certain allelopathy on theArabidopsis thaliana，and the allelopathy enhanceswith the increase of concen-tration.Themalondialdehyde（MDA）content ofArabidopsis thalianaseedlings riseswith the increase in concentration of extract under the rhizosphere ZhongZhu 1 treatment.Compared with control，malondialdehyde（MDA）content of seedlings reduced in lower concentration and increased in higher concentration of extract under the rhizosphere Xiangzhu 7 treatment.The superoxide dismutase（SOD）activity decreased with the rising of treatment concentration.QPCR detection results showed that the gene expressive quantity of YUCI reduced with the increase ofwater extract concentration under the processing of two ramie varieties.In conclusion，with the increase of the extract concentration，ramie has an increase Allelopathy onArabidopsisgrowth.

ramie；rhizosphere soilwater extract；Arabidopsis thaliana；allelopathic effect；antioxidant enzymes；YUC1 gene expression quantity

S563.1

A

1671－3532（2017）02－0064－05

2016－10－31

国家麻类产业技术体系（CARS－19－E20）；国家自然科学基金（31471543）；湖南省研究生科研创新（CX2015B232）；中国农业科学院科技创新工程（ASTIP－IBFC07）

刘楠楠（1991－），女，湖北枣阳人，硕士研究生，主要从事苎麻生理与生化研究。E－mail：422721493＠qq.com

*通讯作者：崔国贤（1963－），男，教授，博士生导师，从事麻类栽培育种、生理生态及植物营养生理研究。E－mail：gx－cui＠163.com