浅谈3-[2-(7-氯-喹啉-2-基)-乙烯基]-苯甲醛纯度分析方法验证

＊黄晓萍

（浙江新三和医药化工股份有限公司 浙江 312369）

浅谈3-[2-(7-氯-喹啉-2-基)-乙烯基]-苯甲醛纯度分析方法验证

＊黄晓萍

（浙江新三和医药化工股份有限公司 浙江 312369）

目的：建立单甲醛纯度检测方法及方法学验证，确认其方法的适用性，为纯度检验标准操作程序提供依据。方法：采用高效液相色谱方法进行测定。结果：3-[2-(7-氯-喹啉-2-基)-乙烯基]-苯甲醛（下面简称单甲醛）纯度测定方法其专属性测定产品和原料的分离度、系统适应性，方法精密度、方法耐用性、检测限、定量限均符合验证可接受标准，该有关物质及纯度测定方法可靠、可行。

高效液相色谱；单甲醛；纯度；分析方法验证；专属性；系统适应性；检测限；定量限；精密度；耐受性；方法精密度。

1.前言

孟鲁司特钠是一种口服的选择性白三烯受体拮抗剂，能特异性抑制半胱氨酰白三烯（CysLTs）受体从而达到预防治疗支气管哮喘病的作用。据WHO统计，全球哮喘患者数达2．75亿人，每年有25万人以上死于哮喘，我国的哮喘发病率为1%-4%，儿童患病率约2%。中国哮喘病患者数目3000万人。单甲醛产品是合成孟鲁司特钠的重要中间体。为了保证分析检测结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的准确性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。从本质上讲，方法验证就是根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法符合检测项目的要求。方法验证在质量控制上有重要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是制订质量标准的基础。验证内容包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不尽相同。本文就是单甲醛纯度分析方法进行了验证，确认其方法的适用性，为纯度检验标准操作程序提供依据。

2.试验部分

(1)仪器与试剂

①仪器。仪器：Waters液相色谱。检测器：PDA检测器。色谱柱：ZORBAX SB-PHENYL 4．6mm×250mm (5μm)。②试剂。乙腈为色谱级默克乙腈，四氢呋喃为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水，单甲醛(自制)。③溶液的制备。流动相：A．取1．0ml的三氟乙酸于1000ml水中（0．1%TFA），脱气。B．取1．0ml的三氟乙酸于1000ml乙腈中（0．1%TFA），脱气。

(2)系统测试

①色谱条件。流速：2．0ml/min，检测波长：220nm柱温：30℃。进样量：20μl。溶剂：1：1的四氢呋喃和乙腈溶液。梯度程序：略。②系统稳定性试验。A．目的：验证本试验所用仪器设备系统是否稳定。B．操作步骤：在上述色谱条件下，准备样品溶液，混匀，超声波中5min，放在254nm的紫外光下照射15min，本产品含量约0．1mg/ml。进空白溶液，确保没有外来杂质峰的干扰。进系统稳定性溶液：a．本产品保留时间约为8．7-9．7min；b．相应的杂质必须进行洗脱出来；c．单甲醛和cis-Monoaldehyde峰的分离度（the resolution factor (R)）大于2。只有符合上面3个要求的系统才是稳定的。

(3)系统适应性

①目的：确认本仪器系统符合纯度测定要求，连续多次进样的重复性符合要求。②可接受标准：系统适应性试验，样品峰的理论塔板数不得低于3000，与相邻峰能达到基线分离，系统精密度的RSD不得过2．0%。③操作步骤：按纯度测定方法，用单甲醛样品制成试验溶液，连续进样5次，记录色谱图。计算主峰理论塔板数；与相邻峰的分离情况；计算重复进样主峰与相邻峰分离度的相对标准偏差。④试验结果：略。⑤结论：该产品有关物质及纯度测定方法，按单甲醛峰计算的理论塔板数均大于3000，单甲醛与相邻杂质均能有效分离，连续重复进样单甲醛与相邻杂质的分离度的相对标准偏差小于2．0%。系统适应性试验满足验证可接受标准。

(4)方法专属性

①目的：验证该测定方法原料与产品、杂质与产品能很好分离，且不受溶剂的干扰。②可接受标准：方法专属性测试：样品、溶剂、原料混合测试，原料与样品、溶剂能有效离。③操作步骤：A．供试溶液配制：a．测试溶液：溶解30mg的样品于50ml的四氢呋喃中，用乙腈定容到100ml，混匀，超声波中5min，样品溶液的含量约为0．3mg/ml。b．系统稳定性溶液准备：准确称取10．0mg的单甲醛标准样品于100ml容量瓶内，用50ml的四氢呋喃溶解，再用乙腈定容到刻度，混匀，超声波中5min，放在254nm的紫外光下照射15min，单甲醛含量约为0．1mg/ml。c．其它溶液配制：略。d．取系统稳定性溶液，7-氯喹哪啶，间二苯甲醛，甲苯，单甲醛酸，二聚体溶液各5ml于100ml容量瓶内，用1∶1的四氢呋喃乙腈溶液定容到刻度，混匀，超声波中超声5min备用。e．溶剂：1∶1的四氢呋喃和乙腈溶液。B．测定：按有关物质测定方法，分别取上述供试溶液和溶剂注入色谱仪，记录色谱图。C．试验结果图：略。D．结论：该产品有关物质及纯度测定方法，7-氯喹哪啶，间二苯甲醛，甲苯，此3种原料与样品均能有效分离，单甲醛酸，二聚体，此2种杂质与样品均能有效分离，原料与样品，杂质与样品的分离度均满足验证可接受标准。

(5)检测限

①目的：确定在本色谱条件下，样品能被有效检出的最低量。②可接受标准：检测限符合S/N=3±1。③操作步骤：按纯度测定方法，用供试品制成试验溶液，用溶剂逐级稀释该溶液，注入色谱仪，记录色谱图，直到符合S/N=3±1，根据此时溶液的浓度计算出本品的检测限。检测限＝满足S/ N=3±1的样品浓度（μg/ml）×进样量（20μL）。④检测限测定结果：0．4μg/ml。⑤结论：该产品有关物质及纯度测定方法检测限为8ng，检测限符合S/N=3±1，可接受标准。

(6)定量限

①目的：确定在本色谱条件下，样品能被准确检出的最低量。②可接受标准：定量限符合S/N=10±1。③操作步骤：按纯度测定方法，用供试品制成试验溶液，用溶剂逐级稀释该溶液，注入色谱仪，记录色谱图，直到符合S/N=10±1，根据此时溶液的浓度计算出本品的定量限。定量限＝满足S/N=10±1的样品浓度（μg/ml）×进样量（20μL）。④定量限测定结果：1．45μg/ml。⑤结论：该产品有关物质及纯度测定方法定量限为29ng，定量限符合S/ N=10±1可接受标准。

(7)方法精密度

①目的：确认连续多次测定的重复性符合要求。②可接受标准：方法精密度测试主峰面积的RSD不得过2%。③操作步骤：A．按纯度测定方法，用样品制成试验溶液，连续进样5次，计算主峰理论塔板数；与相邻峰的分离情况；计算重复进样主峰面积的相对标准偏差。B．按纯度测定方法，取一批样品平行称取6份，制成供试液，依次测定纯度，每个样品测定两次，记录色谱图。计算6份样品纯度测定的相对标准偏差。C．试验结果略。D．结论：该产品有关物质及纯度测定方法，按单甲醛峰计算的理论塔板数均大于3000，单甲醛与相邻杂质均能有效分离，连续重复进样主峰面积的相对标准偏差小于2．0%,连续多次进样单甲醛+二聚物纯度的相对标准偏差小于2．0%。方法精密度试验满足验证可接受标准。

(8)方法耐用性

①目的：确认测定条件发生改变时，对测试结果的影响程度。②可接受标准：A．改变流速时样品峰的理论塔板数不得低于3000，达到基线分离，与原条件比较样品纯度RSD不得过2．0%；B．考察供试品溶液的稳定性时样品纯度的相对标准偏差不得过2．0%。③操作步骤：A．改变流速：改变流速为1．8ml/min、2．2ml/min，记录色谱图，计算主峰理论塔板数，与相邻峰的分离情况，与原条件测定结果比较计算纯度的相对标准偏差。B．考察供试品溶液的稳定性：分别在第一次测定后的1．0h、2．0h、3h、4h、8h测定样品纯度，计算不同时间纯度的RSD。④试验结果：略。⑤结论：该产品有关物质及纯度测定方法，改变流速后样品主峰的理论塔板数均大于3000，单甲醛与相邻杂质的分离度均符合要求，与原条件比较样品纯度RSD均小于2．0%。供试溶液在放置0h、1．0h、2．0h、3h、4h、8h后测定的样品纯度的RSD均小于2．0%。方法耐用性试验满足验证可接受标准。

3.综合结论

综上所述，单甲醛产品纯度测定方法其专属性测定产品和原料的分离度、系统适应性、检测限、定量限、方法精密度、方法耐用性均符合验证可接受标准，该有关物质及纯度测定方法可靠、可行。该分析方法适用于本公司单甲醛产品纯度的测定。

[1]FDA.Guidance for Industry:analytical procedures and methods valid ation,chemistry,manufacturing,and controls documentation(Draft),2000.8.

[2]ICH Q2A. Test on Validation of Analytical Procedures.

[3]ICH Q2B. Validation of Analytical Procedures:Methodology.

[4]李晓敏.浅谈如何开发和验证高效液相色谱检测方法.现代测量与实验室管理,1005-3387（2010）06-0027-30.

[5]李发美.医药高效液相色谱技术.1999,10,1.

[6]《药品生产验证指南》(2003),化学工业出版社,2003-07-01.

[7]吕绍杰,杜宝祥.化工标准化.化学工业部技术监督司,1999,9.

[8](美)L·R·森德尔, J·J·柯克兰, J·L·格莱杰克著.张玉奎,王杰,张维冰译.实用高效液相色谱法的建立（第二版）2001,7.

[9]《中华人民共和国药典》,2005年版一部.国家药典委员会.北京:化学工业出版社,2005,1.

[10]《通用化工产品分析方法手册》编写组.通用化工产品分析方法手册.北京化学工业出版社,1999.

黄晓萍（1980～），女，浙江新三和医药化工股份有限公司，研究方向：质量管理。

((责任编：牛玉娟)

Introduction to 3 - [2 - (7 - chlorine - quinoline - 2 - base) - vinyl] - the purity of benzaldehyde methods validation

Huang Xiaoping

( pharmaceutical and chemical industry co., ltd. Zhejiang, 312369 )

Objective∶ Build the purity detection method and methodology verification for single formaldehyde and affirm the adaptability of this method, so that to provide basis for purity detection standard operation procedure. Method:Adopt the high performance liquid chromatography method to take the testing. Result∶ 3-[2-(7-Chlorine-Quinoline-2-Base)-Vinyl]-Benzaldehyde (hereinafter referred to as single formaldehyde) purity testing method result of products specificity, raw material resolution, system adaptability, precision of method, method durability, limit of detection, limit of quantification all meet the acceptable standard of verification, besides, the related substances and purity testing method is reliable and feasible.

high performance liquid chromatography；Single formaldehyde；Purity；Analysis method validation；Exclusive；System adaptability；Detection limit；Quantitative limit；Precision；Tolerance；Method precision

Q

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