75%百菌清对山茶枯斑病菌抑菌机制的初步研究

李小霞　肖仲久　姜仕敏

【摘 要】为了初步探明药剂百菌清对山茶枯斑病菌的抑菌机制，本论文进行了百菌清对病原菌相关酶活性的测定，实验结果显示：百菌清对山茶枯斑病菌体可溶性蛋白，还原糖，几丁质酶，几丁糖含量的活性均有一定程度的影响。

【关键词】山茶；枯斑病病菌；酶活性

山茶花（Camellia japonica L.）是山茶花科的常绿灌木，又名曼阳罗树、红茶花等，是常见的观赏植物和药用植物，具有凉血，止血，散瘀，消肿等功效[1]。本课题组前期鉴定了山茶枯斑病由交链格孢菌（Alternaria alternata）侵染引起。2016年调查发现，该病害在贵州遵义发生严重，发病高的盆景园发病率高达33%，常引起植株大落叶，严重影响植株的观赏价值和药用价值。

本试验前期通过室内毒力测定发现，供试几种药剂中，75%百菌清对山茶枯斑病病菌的抑菌效果最佳，因此，为明确该药剂抑菌机制，对75%百菌清处理后的病菌菌丝相关酶活性进行了测定，以求为抑菌机制的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

山茶枯斑病样本分别采自遵义桐梓县松坎镇、正安县土坪镇及遵义市区凤凰山、三阁公园，样本经分离、纯化后置于4℃保存备用。

1.2 供试药剂

75%百菌清（WP），购自广东中讯农科股份有限公司。供试药剂其它主要包括：Tris-HCl（0.05mol/L，pH=7.5），考马斯亮蓝G-250溶液，3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液；对二甲氨基苯甲醛试剂（DMAB试剂），0.8mol/L四硼酸钾缓冲液（pH=9.1）；1%胶状几丁质悬浮液（Rodriguex-Kabana）等。

1.3 试验方法

1.3.1 菌丝粗体液制备

供试菌株在PDA平板培养48小时（25℃），用直径为5mm打孔器取菌蝶接入50ml PD培养液中，摇床中培养5天（120r/min，25℃），然后用75%百菌清药剂（终浓度为25ug/ml）进行处理，以不加药剂为对照，每个组重复处理3次。并分别在处理后1h、3h、6h、12h和24h收集菌丝，蒸馏水冲洗干净后滤纸吸干，-20℃保存备用。然后参照肖仲久等[2]的方法，进行菌丝粗提液制备。

1.3.2 可溶性蛋白质含量的测定

参照肖仲久等[2]的方法，采用考马斯亮蓝G-250溶液测定蛋白质含量，波长595nm处测定OD值，并绘图。

1.3.3 还原性糖含量的测定

采用3，5二硝基水杨酸（DNS）比色法进行还原性糖的含量，于波长540nm波长处测定OD值，并绘图。

1.3.4 几丁糖含量的测定

取1.3.1制备的菌丝粗提液0.2ml，加入0.1ml硼酸钾（0.8mol/L），沸水中煮沸3min，冷却后加入3ml 1%的DMAB，36℃保温20min，冷却，于波长544nm处测定其OD值，并绘图。

1.3.5 几丁质酶活性的测定

1%胶状几丁质悬浮液参照Rodriguex-Kabana 的方法[3]，几丁质酶活性的测定参照顾向阳[4]等的方法，以OD值（波长544nm）为纵坐标，药剂处理时间为横坐标，绘图。

2 结果

2.1 可溶性蛋白质含量的测定

实验结果显示（图3），75%百菌清处理山茶枯斑病病菌后，菌体内可溶性蛋白含量在处理后1-6h呈现逐渐升高的趋势，药剂处理6h后菌体内可溶性蛋白含量最高，比对照组高了26%，在处理6h后酶活性逐渐降低，并在处理24h后菌体内可溶性蛋白含量与对照组的变化趋势相接近。

2.2 还原性糖含量的测定

实验结果显示（图4），菌体内还原糖含量在处理后直到3h前是先升高的，3h后才开始呈现出逐渐下降的趋势，75%百菌清处理菌丝3h后还原糖含量与对照组比，差距最大，比对照组高了24.1%。在药剂处理12h后，还原糖含量的变化趋势与对照组水平相当，24h后比对照低14.4%。

2.3 几丁糖含量的测定

百菌清处理山茶枯斑病病菌后，24h内菌体内几丁糖含量的变化趋势与对照组相类似，但总体看处理组含量高于对照，处理24h后幾丁糖含量与对照组差距最大，较对照组高63%。

2.4 几丁质酶活性的测定

百菌清处理山茶枯斑病病原菌体后，在24h内表现出起伏不定的趋势，但总体来看，处理组较对照组高，处理24h后几丁质酶活性与对照组基本趋于同一水平，处理3h后处理组较对照组高39.2%。说明药剂百菌清能提高几丁质酶活性，从而使菌丝无法正常生长。

3 讨论与结论

研究表明，百菌清防治山茶枯斑病具有非常好的效果，为进一步完善其作用机制，明确其抑菌机理。故用可溶性蛋白，还原糖，几丁糖变化，几丁质酶来测其活性。

可溶性蛋白测定结果表明：75%百菌清处理山茶枯斑病菌后的变化趋势表明，百菌清在短时间内诱导了菌体产生了相当量的抗药性基因的表达，随着时间的延长，该类蛋白的产生受到了抑制，也即是药物对该菌的抑制作用方式之一。

还原糖测定结果表明：百菌清处理组的山茶枯斑病菌体内还原糖含量比对照组高，但效果不是很明显，药剂处理12h后，还原糖含量的变化趋势与对照组相似，24h后处理组比对照低14.4%。表明百菌清处理菌丝一段时间后（12h），可阻碍山茶枯斑病菌丝从环境中吸收还原糖，从而抑制山茶枯斑病菌丝正常生长。

几丁糖测定结果表明：百菌清处理山茶枯斑病病原菌3h，几丁糖含量与对照组相比达最大值，24h后几丁糖含量与对照组差距越来越大，说明在一定时间内，百菌清对山茶枯斑病菌的生长有抑制作用，随着时间延长，抑制作用会逐渐减弱。

几丁质酶测定结果表明：百菌清处理1h后，菌体内几丁质酶活性显著升高，到3h达最大值，而后逐渐降低，但仍高于对照，这表明，百菌清可能诱导山茶枯斑病病菌细胞壁水解酶基因的表达，进而细胞结构的完整性受到破坏，使病原菌生长受到抑制甚至死亡[5-7]。

【参考文献】

[1]张艳芳，屈爱桃.山茶花的研究进展[J].中国名族医药杂志，2012，10（10）：41-44.

[2]肖仲久，李小霞，邹钦.氟硅唑对白术白绢病菌抑制机制的初步探究[J].农药，2013，52（6）：439-441.

[3]Rodriguex-Kabana R et al.The determination of soil chitinase actibity： Conditions for assay and ecological studies[J].Plant and Soil，1983，75：95-103.

[4]顾向阳，胡正嘉.一种测定土壤几丁质酶活性的方法[J].土壤通报，1994，25（6）：284-285.

[5]管原洁，[日]副岛正美.蛋白质的定量法[M].2版.张旭，译.北京：农药出版社，1981：186-188.

[6]RICHARD P，TOM M，ISABELLE G，et al.Sensitivity distribution of Septoria tritici isolates to flusilazole for consecutive years 1993，1994 and 1995 in France，Germany and the United Kingdom[J].Pestic Sci，199，54（3）：258-260.

[7]齐永志，张小风，赵卫松，等.梨黑星病菌对氟硅唑的敏感性及与不同杀菌剂之间的交互抗性[J].农药学学报，2012，14（2）：165-169.

[责任编辑：田吉捷]