代谢型谷氨酸受体4的真核表达及其在乳腺癌细胞增殖中的作用

肖斌，陈丽丹，孙朝晖，廖扬，杭建峰，陈建芸，张蓉，李林海

广州军区广州总医院 检验科，广东 广州 510010

代谢型谷氨酸受体4的真核表达及其在乳腺癌细胞增殖中的作用

肖斌，陈丽丹，孙朝晖，廖扬，杭建峰，陈建芸，张蓉，李林海

广州军区广州总医院 检验科，广东 广州 510010

目的：建立代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）在乳腺癌细胞MCF-7中高表达的模型，探索mGluR4的亚细胞定位及其在乳腺癌增殖中的作用。方法：提取MCF-7细胞总RNA并逆转录为cDNA；PCR扩增mGluR4基因；利用无缝克隆技术快速构建以pENTER为载体的mGluR4重组表达质粒；通过Western印迹和免疫荧光实验检测mGluR4在MCF-7细胞中的表达及定位；利用CCK8实验观察mGluR4对MCF-7细胞增殖的影响。结果：构建了能够在MCF-7细胞中高表达的mGluR4真核表达质粒，免疫荧光结果显示mGluR4定位于细胞膜和细胞质，CCK8实验表明高表达mGluR4显著促进乳腺癌细胞的增殖能力。结论：为探索mGluR4的相关功能制备了必要工具，为研究mGluR4在乳腺癌增殖中的分子机制奠定了基础。

代谢型谷氨酸受体4；乳腺癌；真核表达；增殖

谷氨酸盐是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，它通过与细胞膜表面的离子型受体（ionotropic glutamate receptors，iGluR）和代谢型受体（metabotropic glutamate receptors，mGluR）结合，调控胞内信号通路传导，引起一系列生理或病理学效应[1]。mGluR家族属于G蛋白偶联受体，由8个成员组成。根据不同氨基酸序列的相似性及偶联蛋白的类型，可将这8种亚型分为3组：Ⅰ组包括mGluR1和mGluR5，与Gq偶联；Ⅱ组包括mGluR2和mGluR3，与Gi和Go偶联；Ⅲ组包括mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8，与Gi和Go偶联。mGluR与膜内G蛋白偶联，通过G蛋白介导的胞内第二信使信号传导，产生慢生理反应，在离子通道调节、神经元兴奋与神经递质释放等方面发挥重要作用[2]。

尽管mGluR在神经系统中的研究已较为详尽，但是其在肿瘤发生发展过程中的作用机制仍然不清楚。研究表明，mGluR的配体——谷氨酸盐能够促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这一进程可能与谷氨酸盐和mGluR的结合有关[3]。在mGluR各亚型中，对mGluR5在肿瘤中的作用的研究最为详尽。mGluR5高表达于鳞状上皮细胞癌，抑制其表达能够减缓肿瘤生长[4]；另外，肝脏组织特异性表达mGluR5，而不表达与其同组的mGluR1。mGluR5通过MAPK/ERK通路促进肝癌细胞的迁移和侵袭能力[5]。然而，mGluR4在肿瘤发生发展中扮演的角色仍然是未知数。mGluR4是适应性免疫的重要调节因子[6]，其基因的多态性与骨肉瘤的敏感性及发展进程密切相关[7-9]。基于mGluR4的前期研究报道及mGluR各亚型在多种肿瘤进程中的作用，我们推测mGluR4可能在肿瘤增殖过程中发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌细胞MCF-7购自中国科学院上海细胞库；大肠杆菌TOP10感受态细胞购自天根生化（北京）有限公司；pENTER真核表达质粒购自山东维真生物科技有限公司；Total RNA KitⅠ购自Omega Bio-Tek公司；质粒小抽试剂盒及2×PCR预混液购自Biotool公司；First-Strand cDNA Syn⁃thesis Supermix购自北京全式金生物有限公司；MluⅠ内切酶购自宝生物（大连）有限公司；AsiSⅠ内切酶购自北京NEB公司；One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；X-treme⁃GENE HP DNA Transfection Reagent购自Roche公司；mGluR4抗体购自Abcam公司；抗Flag标签抗体、羊抗鼠HRP标记二抗、羊抗兔HRP标记二抗购自Bioworld公司；绿色荧光标记的羊抗兔二抗及DAPI购自Thermo fisher公司；CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所。

1.2 总RNA的提取及逆转录

按照试剂盒操作步骤从3×106MCF-7细胞中抽提总RNA；以总RNA为模板，用First-Strand cDNA Synthesis Supermix试剂盒合成cDNA第一链［①配制逆转录反应体系：RNA模板500 ng，Oligo（dT）18（0.5 μg/μL）1 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，RT/RI酶混合液1 μL，加入无RNA酶水至总体积20 μL；②轻轻混匀，42℃孵育30 min；③85℃加热5 s失活RT/RI酶］。

1.3 基因扩增及重组质粒构建

质粒构建策略采用最新的快速无缝克隆技术（诺唯赞公司）。首先，根据试剂盒要求设计mGluR4基因（Pubmed ID：NM_000841）的特异性上游引物（AGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCA TGCCTGGGAAGAGAGGCTTG，黑体部分为载体序列，下划线为AsiSⅠ酶切位点，斜体部分为基因序列）和下游引物（CTCGAGCGGCCGCGTACGCGTGA TTGCATGGTTGGTGTAAG，黑体部分为载体序列，下划线为MluⅠ酶切位点，斜体部分为基因序列）。PCR扩增条件：98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃15 s，共32个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测大小并对特异性单一条带进行割胶回收。将纯化的DNA片段与线性化的pENTER真核表达质粒（酶切位点：AsiSⅠ和MluⅠ）进行无缝克隆连接，连接产物转入大肠杆菌TOP10感受态细胞，将菌液涂布在含卡那霉素（Kan+）的平板上过夜培养，挑取单克隆菌落，过夜振荡培养后提取质粒，利用双酶切鉴定及测序验证插入序列无误后，质粒用于后续实验。

1.4 质粒转染及Western印迹

将1.2×107MCF-7细胞铺于6孔板中的4个孔，每孔约3×106细胞。待细胞长至80%的汇合度后，按照转染步骤每孔转入2 μg mGluR4重组质粒或空载体，分别于24、36和48 h收集并裂解细胞（空质粒转染细胞于24 h收集），随后进行SDS-PAGE（浓缩胶：80 V，30 min；分离胶：100 V，60 min；转膜条件：恒流180 mA，140 min）。配制5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，室温1 h；加入1∶100稀释的mGluR4抗体，室温孵育2 h，用TBST溶液洗膜4次，每次5 min；加入1∶10000稀释的羊抗兔二抗（HRP标记），室温孵育1 h，用TBST溶液洗膜4次，每次5 min；配制ECL发光液并滴加在膜上，随后用Sage Creation公司的化学发光成像仪（MINICHEMI）进行显影曝光。

1.5 免疫荧光

质粒转染步骤同上，区别在于须在6孔板底部放置一张盖玻片，便于细胞爬片。质粒转染36 h后弃掉细胞培养上清，用PBS清洗2次，并加入4%多聚甲醛溶液500 μL，室温固定15 min；弃上清，用PBS清洗2次，加入500 μL 0.25%的Tri⁃ton X-100，室温静置10 min；弃上清，用PBS清洗4次，加入500 μL PBST（1%BSA，0.1%Tween，溶于PBS中）封闭30 min；弃封闭液，每孔以1∶100的比例加入mGluR4抗体，4℃封闭过夜；用PBS洗涤3次，以1∶1000的比例加入羊抗兔绿色荧光二抗，室温避光孵育90 min；用PBS洗涤细胞3次，滴加DAPI工作液，室温避光孵育10 min；用冰冷的PBS洗涤1次，用抗荧光淬灭封片剂封片并用激光共聚焦显微镜拍照。

1.6 CCK8实验

质粒转染步骤同上，区别在于每孔分别转染0.5、1、2、3 μg重组质粒及0.5 μg空载体。48 h后，将转染的细胞传代至96孔板中，每孔约1×104细胞，体积100 μL；待细胞贴壁后，每孔加入10 μL CCK8工作液，37℃、5%CO2孵育2 h。用酶标仪测定D450nm值。本实验重复3次。

2 结果

2.1 mGluR4的基因扩增及重组质粒构建

以MCF-7细胞的cDNA为模板进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1A，扩增出的单一条带大小约为2700 bp，与mGluR4基因（2739 bp）相近。将该条带进行割胶纯化，并与线性化的pENTER载体直接进行连接反应，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞后涂板培养，挑单克隆菌落振荡培养后提取质粒，经AsiSⅠ和MluⅠ酶切鉴定，重组质粒被切成2段，大片段为线性化载体，小片段为插入基因mGluR4（图1B）。质粒送华大公司测序验证，经序列比对后证实插入序列无误，表明重组质粒构建成功。

2.2 mGluR4在乳腺癌细胞MCF-7中的表达

2 μg重组质粒转染至80%汇合度的MCF-7细胞中，空载体转染组为阴性对照。转染后24、36、48 h分别收集并裂解各组细胞样本进行Western印迹检测，一抗使用抗Flag标签抗体。在不同时间点均检测到了Flag-mGluR4的表达（图2），而空质粒转染组没有发现相应的条带，表明重组Flag-mGluR4蛋白表达成功。

2.3 mGluR4的亚细胞定位

Gene Ontology（GO）预测mGluR4为7次跨膜蛋白，可能定位于细胞膜或细胞质（http://www.uni⁃prot.org/uniprot/Q14833#subcellular_location）。另有研究表明，mGluR4的mRNA广泛见于人的丘脑、下丘脑和尾状核，并高表达于小脑粒细胞[10]。但mGluR4在肿瘤细胞中的定位仍不清楚。为了探索mGluR4在乳腺癌细胞中的定位，我们将重组质粒转染MCF-7细胞，36 h后固定细胞并用抗mGluR4抗体检测蛋白的亚细胞定位。令人惊讶的是，mGluR4除了定位于已知的细胞膜外，还分布于细胞质中，而对照组无荧光表明实验组的荧光为特异性表达（图3）。mGluR4在乳腺癌细胞中的这种有趣的分布，为我们进一步研究其分子机制提供了线索。

图1 mGluR4重组质粒的构建

图2 转染后mGluR4真核表达质粒在乳腺癌细胞MCF-7中的表达

2.4 mGluR4在乳腺癌细胞增殖中的作用

为了证实mGluR4在乳腺癌细胞增殖中的作用，我们将不同浓度的重组质粒（空载体0.5 μg，重组质粒0.5、1、2、3 μg）分别转染至6孔板中培养的MCF-7细胞，48 h后将细胞传代至96孔板中，利用CCK8实验检测细胞增殖活性。结果如图4，细胞增殖活力（D450nm）随着质粒转染浓度的增加而增强，并且实验组细胞的增殖能力显著高于对照组。

图3 mGluR4的亚细胞定位

图4 mGluR4促进乳腺癌细胞的增殖

3 讨论

谷氨酸盐受体是神经信号传递的重要枢纽，广泛参与神经元调节、轴突发育及突触可塑性形成等正常及病理状态下的大脑神经活动，而mGluR是其重要的分支之一。mGluR通过胞内段偶联的G蛋白传递分子信号，激活第二信使产生，从而导致细胞代谢发生改变。尽管mGluR在神经系统中的作用机制已研究得较为详尽，但其在肿瘤，尤其是乳腺癌发生发展中的作用还有待发现。前人的一些研究为本文的实验设计提供了依据：Venneti等利用正电子发射断层扫描技术（PET）发现谷氨酸示踪剂可以被神经胶质瘤吸收来辅助其生长，而不会被周围健康组织吸收[11]，这一现象可能与谷氨酸盐受体在神经胶质瘤中的高表达有关[12]；而细胞分泌的谷氨酸能通过MAPK和PI3k/Akt通路促进黑色素瘤和神经胶质瘤的增殖和转移[13-14]；更直接的证据表明mGluR4也可以激活MAPK/ERK通路促进神经元祖细胞的增殖[15]。经过科学推测及实验证实，我们首次发现mGluR4能够促进乳腺癌细胞的增殖能力。

本研究还发现了另一个有趣的现象，即mGluR4广泛分布于乳腺癌细胞的细胞膜和细胞质内。根据GO分析所得mGluR4的拓扑结构及其跨膜属性，我们预测mGluR4可能同样分布于一些细胞内膜上；而mGluR4在细胞内膜中的功能仍有待发现，这也是本课题组未来的研究方向之一。

总之，我们构建并表达了mGluR4真核表达质粒，分别利用激光共聚焦显微镜和CCK8试剂观察了mGluR4的亚细胞定位及其在乳腺癌增殖中的作用，这就为研究mGluR4的分子机制制备了有效的工具，为探索mGluR4在乳腺癌中的生物学功能奠定了基础。

[1]武永乐,丁惠国.代谢型谷氨酸受体在肿瘤发生和发展中的作用[J].中华肝脏病杂志,2014,22(7):558-560.

[2]魏东升,胡国渊.代谢型谷氨酸受体[J].生命科学, 1997,(1):6-10.

[3]Koochekpour S,Majumdar S,Azabdaftari G,et al.Se⁃rum glutamate levels correlate with Gleason score and glutamate blockade decreasesproliferation,migration, and invasion and induces apoptosis in prostate cancercells[J].Clin Cancer Res,2012,18(21):5888-5901.

[4]Park S Y,Lee S A,Han I H,et al.Clinical signifi⁃cance of metabotropic glutamate receptor 5 expression in oral squamous cell carcinoma[J].Oncol Rep,2007, 17(1):81-87.

[5]Wu Y L,Wang N N,Gu L,et al.The suppressive ef⁃fect of metabotropic glutamate receptor 5(mGlu5)inhi⁃bition on hepatocarcinogenesis[J].Biochimie,2012,94 (11):2366-2375.

[6]Fallarino F,Volpi C,Fazio F,et al.Metabotropic glu⁃tamate receptor-4 modulates adaptive immunity and re⁃strains neuroinflammation[J].Nat Med,2010,16(8):897-902.

[7]Savage S A,Mirabello L,Wang Z,et al.Genomewide association study identifies two susceptibility loci for osteosarcoma[J].Nat Genet,2013,45(7):799-803.

[8]Wang K,Zhao J,He M,et al.Association of GRM4 gene polymorphisms with susceptibility and clinicopath⁃ological characteristics of osteosarcoma in Guangxi Chi⁃nese population[J].Tumour Biol,2016,37(1):1105-1112.

[9]Jiang C,Chen H,Shao L,et al.GRM4 gene polymor⁃phism is associated with susceptibility and prognosis of osteosarcoma in a Chinese Han population[J].Med Oncol,2014,31(7):50.

[10]Makoff A,Lelchuk R,Oxer M,et al.Molecular char⁃acterization and localization of human metabotropic glu⁃tamate receptor type 4[J].Brain Res Mol Brain Res, 1996,37(1-2):239-248.

[11]Venneti S,Dunphy M P,Zhang H,et al.Glutaminebased PET imaging facilitates enhanced metabolic eval⁃uation of gliomas in vivo[J].Sci Transl Med,2015,7 (274):217r-274r.

[12]Prickett T D,Samuels Y.Molecular pathways:dysregu⁃lated glutamatergic signaling pathways in cancer[J]. Clin Cancer Res,2012,18(16):4240-4246.

[13]Takano T,Lin J H,Arcuino G,et al.Glutamate re⁃lease promotes growth of malignant gliomas[J].Nat Med,2001,7(9):1010-1015.

[14]Choi K Y,Chang K,Pickel J M,et al.Expression of the metabotropic glutamate receptor 5(mGluR5)induc⁃es melanoma in transgenic mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(37):15219-15224.

[15]Duan Z,Zhang X,Zhu G X,et al.Activation of mGluR4 promotes proliferation of rat neural progenitor cells while mediating activation of ERK1/2 signaling pathway[J].Cell Mol Biol,2013,59(Suppl):L1809-L1817.

Eukaryotic Expression of mGluR4 and its Role in the Pro⁃liferation of Breast Cancer Cell

XIAO Bin,CHEN Li-Dan,SUN Zhao-Hui,LIAO Yang, HANG Jian-Feng,CHEN Jian-Yun,ZHANG Rong,LI Lin-Hai*
Department of Laboratory Medicine,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA,Guang⁃zhou 510010,China

Objective:To express metabotropic glutamate receptor 4（mGluR4）in breast cancer cell line MCF-7, further explore the subcellular localization and the role of mGluR4 in cell proliferation.Methods:The total RNA was extracted from MCF-7 cells and was subsequently reversed into cDNA,and from which,mGluR4 gene was amplified by PCR.Recombinant mGluR4 expression plasmid was constructed using one step cloning kit.Western blotting and immunofluorescence assays were applied to detect the expression and localization of mGluR4 respec⁃tively.The effect of mGluR4 on the proliferation of MCF-7 was also measured.Results:The mGluR4 was local⁃ized in the cytoplasm and membrane of MCF-7 cells.The expression of mGluR4 could significantly enhance the proliferation of breast cancer cells.Conclusion:This research will provide a useful tool for studying the function of mGluR4 and lay the foundation of the molecular mechanism of mGluR4 in the proliferation of breast cancer.

metabotropic glutamate receptor 4;breast cancer;eukaryotic expression;proliferation

Q78

A

1009-0002（2017）02-0109-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.008

2016-09-29

2015年广州市科创委项目（201604040003）

肖斌（1986-），男，博士

李林海，（E-mail）mature303@126.com

*Corresponding anthor,E-mail:mature303@126.com